经皮注射骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子促进兔骨缺损愈合
李亚非　胡蕴玉　李　青　吕　荣　王纪保　王　军　李雪冰　杨　光

摘要

本文报告了以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为牛骨形态发生蛋白(bBMP)和基因重组碱性人成纤维细胞生长因子(bFGF)可溶性载体，将三者的混悬液经皮注射入小鼠肌肉和兔桡骨缺损处的实验研究。经不同时间点的X线拍片，组织学检查，结果发现成骨量及骨缺损愈合程度明显高于对照组，P<0.01。注射入小鼠肌肉后及兔桡骨缺损区，观察到与新骨伴随的血管增生。证实该两种因子的联合植入，成骨作用大于单用骨形态发生蛋白，骨成熟较早，聚乙烯吡咯烷酮是骨生长因子的有效缓释载体。多种骨生长因子经皮注射，可望成为一种治疗骨折、骨缺损新的有效方法。

关键词：骨形态发生蛋白，骨诱导，载体，成纤维细胞生长因子，经皮注射

用骨生长因子治疗骨折、骨缺损、骨不连是骨科领域近年研究非常活跃的课题，但还处于探索阶段。已经证实骨生长因子的缺乏或活性不足及骨痂组织的血循环障碍，是骨延迟愈合乃不连接的重要原因。而骨诱导因子BMP与血管生成因子FGF的联合局部应用，可能对骨不连的治疗有很积极的作用。目前尚缺乏这方面的报告。因此我们制备了一种能经皮注射的骨诱导剂，内含bBMP和bFGF，以PVP为载体和溶媒，注射入小鼠肌肉和兔桡骨缺损处。关于材料的制备、理化性能检测、生物学评价等将另文报告，本文重点报道制剂植入后，用X线拍片，骨痂钙含量测定及组织学检查方法，观察其成骨效应及组织学反应。

材料与方法

一、制剂生物相容性及诱导成骨实验
　　bBMP为我所按文献报道方法提取，bFGF为冻干品(Synergen, Boulder,CO, U.S.A)。PVP为德国进口分装品。昆明小鼠72只，分为4组，每组18只。Ⅰ组一侧股部肌注bBMP2mg/bFGF100ng/PVP适量的混悬液0.3ml，Ⅱ组注射bBMP　2mg/PVP混悬液0.3ml，Ⅲ组注射bBMP　2mg/0.3ml注射用水。Ⅳ组注射PVP溶液0.3ml。术后10天各组处死6只，立即取材切片，HE染色，光镜观察。21天时处死其余小鼠，每组的6只同上法做组织切片，6只取材后于原子吸收分光光度计测定钙含量。

二、兔桡骨缺损修复实验
　　纯种大耳白兔52只，体重2.0～2.5公斤，随机分为两大组，每组26只。实验分组及处理见(表1)。制剂为冻干品，白色、海绵状，注射前加入注射用水0.5ml，略加振摇，成混悬液。无菌操作下，做成兔双侧桡骨干中段连同骨膜的缺损1.5cm。严密缝合肌肉及皮肤。5天后，一组左侧桡骨缺损处注射A组制剂，右侧注射D组制剂；另一组左侧骨缺损注射B组制剂，右侧注射C组制剂。针头由正常皮肤处刺入直达骨缺损处，注射时阻力很小，无渗漏。各组注射后第2、5、9周时各处死6、10、10只。立即取下双侧尺桡骨，清除肌肉，X线拍片。再以10%中性福尔马林固定，制成脱钙明胶切片，纵切，厚10μm，HE染色，光镜观察。
　　用计算机图像分析系统对9周时X线片显示的新骨进行半定量测定，将X线片置于光源前，摄像系统采集X线片灰度，输入微机，于显示器定格。用鼠标分别沿骨缺损区投影的周缘及新骨投影周缘扫描，采用0—4级评分法　，估评缺损被新骨修复面积的百分比(0，25，50，75，100)，以及骨缺损桥接和骨改建情况。求出各组的平均分数。
　　血管增殖情况的评估，将HE染色的兔桡骨缺损长轴切片置于体视学显微镜下，放大20倍。接通摄像系统，调焦，标定尺度。通过显微镜目镜摄取待测视野。使骨缺损区全部及周围少量正常骨及软组织收入镜头，输入微机，于显示器上将待测视野定格。用鼠标器逐一计数该视野内毛细血管，数据输入微机，计数毛细血管绝对数。每张切片的计数由同一人进行两次，取均值。如果均值的差大于10%，则进行第三次计数。对检测数值进行t检验，P值大于0.05定为无显著差异。

结果

一、小鼠诱导成骨实验
　　镜下可见，术后7天各组均无炎细胞浸润及排斥反应，周围肌组织基本正常。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组均可见新生软骨细胞及间充质细胞增殖，软骨细胞以Ⅰ组最为密集、典型，并有多处软骨岛形成，其间为新生的毛细血管(图1)。Ⅱ组次之，只有单一软骨岛出现，无明显毛细血管增殖。Ⅲ组为散在小软骨岛。PVP呈深染的紫色点状，分布于新骨之间。Ⅳ组PVP染色同Ⅰ组，无炎性及异物反应。21天时，Ⅰ组新生软骨岛。明显较Ⅱ、Ⅲ组密集，成熟度好，可见交织骨、骨小梁、板层骨、红骨髓 。PVP已近完全吸收。钙含量测定Ⅰ组均值为1.02±0.17mg，Ⅱ组为0.35±0.08mg。Ⅲ组为0.21±0.07mg，P<0.01。
　　结果证实，FGF增强了bBMP的骨诱导力，Ⅰ组的成骨量显著高于对照组，并且能见到较明显的血管增生。Ⅱ组的成骨又强于Ⅲ组，且21天时PVP近完全吸收，不引起炎症和免疫排斥反应，因此认为PVP是bBMP的有效缓释载体。

二、兔桡骨缺损修复实验
　　X线检查，A组注射后两周时截骨区断端可见新生骨，4周时新骨量明显增多，在骨缺损中央部出现新骨。结果显示，A组分数最高，且10个标本均显示新骨桥接缺损。在C组分数低于A、B组，4例未能将缺损桥接。单独PVP组未见新骨。由(表2)看出，注射后9周时，A组成骨优于B、C组，而B组优于C组(图2)。同时利用图像分析仪的光密度计功能，对骨缺损区新骨及缺损近侧1.0cm处1.5cm长桡骨干的X线片透光度（单位面积平均值）进行了测定，以二者的比值表示缺损区新骨平均透光度。各组不同时间透光度用方差分析。结果显示，透光度在A组至D组逐渐减少(P<0.01，表2)，透光度在A、B、C组显著高于D组(P<0.01)。
　　组织学检查，注射后2周时，A组骨缺损处可见大片新生软骨性骨痂(图3)，点状深染的PVP散在，无炎细胞浸润无排斥反应。B、C组也有新生软骨，但不够密集。注射后5周时，A组骨缺损内有成熟新骨和骨髓组织，新生骨与两断端连接、延续，并开始改建(图4)。5周时PVP已近完全吸收。9周时A组的骨性骨痂大部改建(图5)，B组小部分改建，C组开始改建，D组断端缺损区为纤维组织。
　　血管增殖情况见(图6)。在A组及B组均有血管增殖，但A组在注射后2周时血管数量显著高于B组。在A组血管长入骨缺损中央部。因此认为大部分血管似起源于缺损周围包括肌肉在内的软组织。并且已有较成熟的骨样组织出现(图3)。在B组也有新生毛细血管及新生软骨形成，但数量显著少于A组(P<0.01)，且血管未能长入缺损中央部。注射后5周时，A组与B组骨缺损区均有毛细血管长入，血管数量无显著差异(P<0.01)，且两组血管数量均比注射后2周天时减少。在D组，14天时无新骨形成，骨缺损区为纤维组织，毛细血管稀少。
　　以上实验结果表明，X线、组织学与测定结果趋势一致，bBMP与bFGF合用时促进骨缺损修复作用较强，且软骨成熟早。而以PVP作bBMP载体时，成骨作用又强于单用bBMP。

讨论

　　骨折后骨缺损、骨不连的治疗是骨科临床的重要课题。现代观点认为，断端局部多种骨生长因子缺乏或活性不足　，以及局部血循不良是形成骨不连的重要因素　。因此除基础治疗外，局部应用多种外源性生长因子可能对促进骨愈合有重要作用　。但需要选择适宜的骨生长因子及其组合，并解决给药途径方法上的问题。
近期的研究发现，人胫骨骨不连组织中， 软骨细胞的超微结构及功能是正常的，但血管数量减少、栓塞，认为缺乏将足量钙质输送到断端的血供，进而导致软骨痂钙化障碍，是骨不连的真正原因　，而与成骨有关的丰富血管网和特殊血管的建立又有赖于成骨因子的刺激　。同时还发现组织中成骨细胞的活性与血流率密切相关　。因此，设法改善骨断端血供状态至关重要。
　　BMP是重要的骨生长因子，对其诱骨作用研究已较多。而FGF最初是从牛脑垂体分离出来的一种蛋白质。后来发现它在人体组织包括骨基质中也广泛存在。对胚胎发育及软、硬组织的修复有重要作用　。体外实验发现，它能促进软骨细胞前质的分化及软骨细胞的增殖和成熟。体内实验则证实它增加异体骨基质诱导成骨量　，并且使新骨替代加快。特别它是一种毛细血管增殖刺激剂　，能促进毛细血管向断端内以及骨移植物中长入，使骨修复早期的组织中软骨岛数量增多　，并使断端骨痂和骨移植物提前血管重建时限　。所以它增加BMP成骨量的原理，可能促进了需要血供的软骨内化骨，加速了软骨痂的成熟和骨化　。由于软骨内化骨与毛细血管形成是骨诱导剂刺激后的重要步骤，我们将bBMP与bFGF复合后植入，小鼠肌袋植入实验中观察到与成骨相伴的毛细血管增生(图1)。而A组兔桡骨缺损区毛细血管数量显著多于B、C、D组，且长入中央区，2周时已有明显骨化(图3)，同时，A组9周时X线片显示新骨面积、骨缺损桥接、骨改建的X分数均为4(表2)，而客观定量反映骨缺损愈合程度的透光度比值又显著高于其它各组(表2)，组织学切片显示，2周及5周时大片软骨形成，9周时骨改建、髓腔再通(图5)。除bBMP的作用外，可能是bFGF使软骨化骨所必需的毛细血管血供的较快发展，使成骨量增加　，软骨成熟提前。然而，注射后5周与9周时，A、B、C组间血管数量却无显著差异(图6)，但A组组织学及X线片成骨仍优于其余各组，这可能是bFGF对骨修复早期发挥作用的结果。增加注射次数及剂量，缩短注射间隔，可能会对血管增殖及成骨有持续刺激作用，这样的实验正在进行中。
将bFGF加入到BMP或其它骨生长因子或骨移植物中，可能会刺激血管长入骨修复区或骨移植物，进一步增加BMP和骨移植物的有效性，并解决某些库骨存在的问题，诸如新骨血供重建迟缓，新骨替代慢等。

　　自牛骨基质中提取的BMP 冻干品为白色粉末，遇水极粘，术中撒布于骨断端时操作不便。对无手术指征的骨折，延迟愈合或骨不连、则需要一种溶媒将BMP液体注射入骨断端血肿或其周围，使BMP均匀分布，诱导骨髓干细胞及周围组织靶细胞。此外，由动物骨基质中提取的BMP量很少，高度纯化的BMP不可能在临床广为应用。而基因工程人BMP距临床实用尚有距离。高度纯化的动物骨BMP，如果植入量少，会在组织内被迅速降解或转运，不能诱导成骨。部分纯化bBMP诱导成骨活性满意，产量明显高于纯品，在不同种属间移植后不引起排斥反应，临床应用部分纯化bBMP较为可行。但部分纯化bBMP难溶于水，给应用带来一定困难。需要一种对bBMP具有赋形填充、助溶或助悬、缓释载体等作用的物质，便于bBMP的撒布或注射。 PVP是人工合成高分子聚合物，具有助溶助悬、分散、络合等性能，药剂学上用来制作代血浆及多种药物缓释载体，安全无毒，可自体内排泄　。实验中采用PVP作为bBMP的载体，制剂为白色疏松冻干品，触之易碎，撒布时容易，加水后迅速成为稳定的混悬液，且有良好的通针性和可注射性。bBMP以PVP为载体时，其成骨作用显著高于对照组，并且吸收快，21天时大部吸收，避免了某些载体吸收过慢，妨碍新骨形成的缺点，证实PVP是bBMP的良好可溶性载体。
　　经皮注射骨诱导剂，具有损伤轻微，适应症广，可重复给药，直接将高效骨诱导物质输送到骨修复区的优点　　，PVP可做为多种骨生长因子可溶性载体。本实验中A组制剂具有强化骨诱导，促血管再生，有利新骨形成和骨折愈合，特别是对那些血运不良的骨折、骨缺损和骨不连的治疗，可能有积极的作用。有多种使用途径。将进一步研究，以期用于临床。


表1　实验分组与处理
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处 理 (注射剂成份)
制剂组别　注射肢体(侧) ──────────────
　bBMP(mg) bFGF(ng) PVP(ml)
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A 26 25 380 0.5
B 26 25 0.5
C 26 25 
D 26 0.5
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表2　9周时X线骨修复分数评估
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组别　 新骨面积 　骨缺损桥接 骨改建 总分 
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A 4 4 4 12
B 3 2 1 6
C 1 1 1 3
D 0 0 0 0
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表3　9周时骨缺损X线片透光度与桥接率
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组别　 透 光 度 桥接率 
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A 0.95±0.27 10/10 
B 0.68±0.19 7/10 
C 0.41±0.08 4/10 
D 0.11±0.02 0/10 
P值 <0.01
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