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BMP成骨活性剂量依赖性研究 李亚非 等
我们建立BMP成骨活性定量分析方法和研究BMP诱导成骨的剂量依赖性。
4.1 以脱抗原牛松质骨为bBMP载体 小鼠肌袋植入实验已证实重组合异种骨(RBX)具有较强的诱导成骨能力[105-107],本实验采用脱抗原牛松质骨作为bBMP的载体,设立不同的bBMP剂量组,观察以牛松质骨为载体时,bBMP的量效关系,了解诱导成骨所需bBMP最小剂量,并对BMP的活性单位及诱导成骨活性定量分析方法进行一定探讨,为下一步研究打下基础。 4.1.1. 材料和方法 4.1.1.1.主要试剂及器材 S-520电子显微镜,日立公司、Du-7分光光度计、Beckman公司,原子吸收分光光度计,日立公司,bBMP,脱抗原牛松质骨,第四军医大学西京医院骨库制备,环氧乙烷灭菌机,西安医科大学,计算机图像分析系统 TS冻干机美国FTS公司 昆明小鼠 第四军医大学动物研究中心 碱性磷酸酶试剂盒 北京化工厂 表4-1 实验分组及处理 组 别 n 处 理 bBMP(mg)/松质骨(mg) A 36 4 10 B 36 2 10 C 36 1 10 D 36 0.5 10 E 36 0.25 10 F 36 0.125 10 对照Ⅰ 36 10 对照Ⅱ 36 4 4.1.1.2.植入物的制备:按Urist的方法[92],从新鲜小牛骨中提取bBMP,获部分纯的bBMP,自然干燥。经小鼠肌袋植入实验证实其活性。取适量牛松质骨,切成3mm×3mm×3mm骨粒,经脱脂,脱蛋白等处理去除其抗原性,再部分脱钙、水洗、冻干[105-107]。修剪成每粒10±0.1mg。测钙含量1.9~2.2μg/10mg(牛松质骨)。扫描电镜观察骨孔径350~500μm,孔率为70%,根据实验分组(表4-1),计算各组所需骨粒总数及bBMP的毫克。共分为8个组,各组样本数均为36个。在A至F组,各组每颗骨粒所含bBMP依次为4mg(A组),2mg(B组),1mg(C组),0.5mg(D组),0.25mg(E组),0.125mg(F组)。对照I为单独松质骨粒,对照Ⅱ为单独bBMP4mg。采用已报告的类似方法,将bBMP溶于适量的4M盐酸胍/0.05M氯化钙液中,再将骨粒投入,混匀,真空排气15分钟,装袋对水透析24小时,4℃。冻干后分装,环氧乙烷消毒,备用。 取A组样品扫描电镜观察,松质骨在结合bBMP后呈实体性疏松绒毛,网状结构,骨孔也填充絮网状bBMP(图4-1)。 4.1.1.3.动物分组及处理 取封闭群昆明小鼠288只,均为雄性,体重20~22g,随机分入上述8个实验组组。无菌手术,将一块骨粒植入小鼠股部的肌间隙内,对照Ⅱ植入bBMP自然干燥品4mg。术后维持相同条件饲养。各组于术后7、14、21天处死12只,12只,12只,每组每次取6块标本做组织学检查,其余组织块用于生化学检查(表4-1)。 4.1.1.4.检查项目及方法 a.组织学检查与图象分析:取材后将标本置于10%中性甲醛中固定12~24小时,然后置复合脱钙液24小时,水洗、脱水、石蜡包埋,制备4um连续性切片,行HE染色和三色染色,光镜下观察并做计算机辅助图象分析[50,75,98,103]。计算机主机为SMD 486/110V微机,内存4M,硬盘250M;图像采集卡为清华大学电子系华业公司MICROSUN-90型512X512,8BIT双帧伪彩色图像采集卡;图像监示器为CASPER 5157微机数模两用彩色监示器;摄像机为STORE-CCD彩色摄像头(PAL-D制,580线);软件采用美国Iamge-Pro V1.6图像处理软件包。将三色染色切片置于体视学显微镜视野内,放大12倍,接通摄像系统,使待测的骨块截面全部收集入视野,仔细调焦,标定尺度,于显示器荧光屏上定格,用鼠标器沿骨块截面周边扫描,周边的新骨也同时计入,作为该张切片上骨性组织总面积。再用同样方法逐一扫描,合计切片上所有新生骨性组织的总面积(包括骨髓、类骨)重复此程序,逐一测量各张切片,结果输入微机进行统计学分析,以百分比表示各组的成骨量[34,46,103]。 新骨面积(mm2) 成骨量%= X 100% 骨块截面(mm2)+骨块周边新骨(mm2) b. 碱性磷酸酶(ALP)测定:按文献报告的方法[73]加以改进。取材后清除标本表面的肌肉,称重,置入玻璃匀浆器中,加入2ml生理盐水,匀浆,离心,10000rpm,10分钟。取上清测ALP活性。以对硝基苯磷酸钠为反应底物。于Beckman Du-7分光光度仪上,410nm比色。以水调零,获读数后查标准曲线,并将数值换算成国际单位,再以标本湿重(mg)为除数,即得ALP的国际单位(U)/mg组织(湿重)。 c.钙含量测定:取上述离心沉淀物用盐酸消化,用原子吸收分光光度仪(Hitachi-7500)测定钙含量,也以标本重量(mg)为除数,得出标本钙量μg/mg组织(湿重)。 采用方差分析做统计学分析。观察不同时间点时各实验组与对照Ⅰ相比是否有显著差异,并进一步做组内两两比较。 4.1.2. 结果 4.1.2.1.组织学检查及图象分析: (表4-2)示组织学检查及图象分析结果: ⑴术后7天时,在A~D组可见大量梭形细胞及肥大的间充质细胞增殖,环绕并分散于骨块之内。但只有A组及对照Ⅱ有典型软骨细胞形成(图4-2)。对照Ⅰ只有少量亚急性炎细胞。 ⑵14天时,A~C组有软骨、类骨形成及软骨钙化,呈弥漫灶性分布。D.E组只有稀疏小软骨岛分布。对照Ⅱ形成的软骨主要位于原植入的bBMP团块周围,中心部位均质,淡染,无细胞成分。 ⑶21天时,A组和B组新生软骨融合成蜿延迂曲的骨小梁,还可见板层骨和新生骨髓(图4-3),部分原植骨吸收替代。C.D.E组21天时只有散在小软骨岛,未见骨髓形成。F组骨块骨孔中有纤维组织增生。对照Ⅰ骨块周围纤维组织包膜形成。 ⑷对照Ⅱ21天时,原bBMP团块周围的“壳”状软骨层形成板层状骨和骨髓(图4-4,4-5)。 ⑸21天时成骨量图象分析结果显示,A组的成骨量是单独植入同剂量bBMP时的2倍(表4-2),p<0.05。各组成骨量随bBMP量减少而减少。 4.1.2.2.ALP测定结果 ALP测定结果见(表4-3,图4-6) ⑴7天时,A~F组ALP水平与对照Ⅰ相比无显著差异,但对照ⅡALP水平则大于其余各组,p<0.05 ⑵14天时,A~D组ALP水平已升高,与对照Ⅰ相比有显著差异,p<0.05,两两比较发现A~D组间差异显著,p<0.05。 ⑶14天时,对照ⅡALP水平显著高于A~C组。p<0.05。 ⑷21天时,在A~F组,其ALP水平与14天时相比略升高,并仍显著高于对照Ⅰ,p<0.05。各组ALP水平随bBMP剂量的递减而递减(图4-6),两两比较在A~C组间有显著差异,而对照ⅡALP水平则陡降(图4-6)。 4.1.2.3.钙量测定结果 钙量测定结果见(表4-3)。 ⑴7天时,A、B组钙量大于对照Ⅰ,p<0.05。 ⑵14天时,A~D组钙量大于对照Ⅰ,p<0.05。各组钙量也随bBMP剂量的减少而递减,两两比较,p<0.05。 ⑶21天时A~F组钙量大于对照Ⅰ,各组钙量仍存在梯度差,p<0.05。并且A~F组钙含量较14天时继续升高。 ⑷对照Ⅱ组钙量14天时开始升高,21天时略有降低,P<0.05(图4-6,表4-3)。 4.1.3. 小结 目前对成骨因子诱导成骨机理的研究不断深入,而bBMP的临床应用也已取得可喜的开端,但由于动物骨来源的BMP提取困难,获取量少、价昂,使其大规模的研究及应用受到一定限制,了解获满意成骨效应的最小BMP剂量,是各国学者极关注的问题[94-96]。同时,对各种成骨因子深入的研究及其复合植骨材料的不断涌现,也对成骨活性的分析提出了更高要求,单纯定性的研究已远远不能满足需要。因此,定量地评价各种成骨因子及其复合植骨材料(不同种属、来源、纯度、剂量及载体等)的诱导成骨能力,已成为一项有重要价值的工作[50,53,94-96]。 本实验利用多指标的观察,对bBMP含量不同的RBX诱导成骨能力进行了定量性研究。结果发现: ⑴RBX的诱导成骨力与其所含的bBMP呈剂量依赖性关系,表现为标本中的钙含量,ALP水平及组织学成骨量与bBMP剂量呈正相关。0.125mgbBMP/10mg牛松质骨(F组)为诱导成骨的下限。我们以此做为RBX人体应用时计算等效剂量的参考。当每10mg松质骨中bBMP含量为0.125mg时,镜下无可见的新骨形成,但其钙量及ALP水平却还是大于对照Ⅰ,该现象值得进一步研究。 ⑵单独植入4mgbBMP时,7天时ALP水平大于RBX组,14天时已显著高于A~F组,但21天时却陡降,小于A组~F组,提示其诱导成骨能力已减弱,对照其组织学所见,14天时bBMP植入物周围形成一层新生骨包壳(图4-4,4-5),21天时该骨壳转化为板层并有骨髓样组织,但成骨量及钙含量(表4-2,4-3)并未增加。结果提示BMP应采用适当的分散形式(如与载体结合)增加与靶细胞的接触,以充分发挥作用[60,61]。 ⑶Deles研究地质学提出的理论[18],从一块岩石随机切取一个横断面,它含某成分的面积分数即等于该成分在整块岩石中的体积分数。从骨组织之切片中计数的某一面积,也近似等于该成分的体积。当新生骨面积占切片相关组织总截面积的20%时,即为C+2级成骨效应[50,75,98,103]。本实验中图象分析显示,21天时,对照Ⅱ成骨量为30%,属C+2级成骨,文献介绍[34]: 1BMP活性单位=产生C+2级异位成骨效应所需的最小BMP剂量。故认为本实验所用bBMP为每4mg为1活性单位(植入2mg和3mgbBMP时未达C+2,结果未列入本文)。仅就BMP而言,相同方法不同时间及批次提取的产品,重量相同而活性却可能有差异,因此,用活性单位而不是重量来表示BMP的剂量似更为客观。本实验显示ALP,Ca含量,图像分析结果变化趋势一致,实验采用的骨定量方法较为可靠。鼠标扫描时,应同时在光镜下对比观察,以免遗漏新骨。
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