BMP成骨活性剂量依赖性研究
李亚非 等

　我们建立BMP成骨活性定量分析方法和研究BMP诱导成骨的剂量依赖性。

4.1 以脱抗原牛松质骨为bBMP载体
　　小鼠肌袋植入实验已证实重组合异种骨(RBX)具有较强的诱导成骨能力[105-107]，本实验采用脱抗原牛松质骨作为bBMP的载体，设立不同的bBMP剂量组，观察以牛松质骨为载体时，bBMP的量效关系，了解诱导成骨所需bBMP最小剂量，并对BMP的活性单位及诱导成骨活性定量分析方法进行一定探讨，为下一步研究打下基础。
　4.1.1.　材料和方法
4.1.1.1.主要试剂及器材
S-520电子显微镜，日立公司、Du-7分光光度计、Beckman公司，原子吸收分光光度计，日立公司，bBMP，脱抗原牛松质骨，第四军医大学西京医院骨库制备，环氧乙烷灭菌机，西安医科大学，计算机图像分析系统 TS冻干机美国FTS公司 昆明小鼠 第四军医大学动物研究中心 碱性磷酸酶试剂盒 北京化工厂
　　　 表4-1　　实验分组及处理
组　别　　　n 　　　 　处　　　理
bBMP(mg)/松质骨(mg) 
　　　A　　　　36　　　　　4　　　　10
　　　B　　　　36　　　　　2　　　　10
　　　C　　　　36　　　　　1　　　　10
　　　D　　　　36　　　　　0.5 10
　　　E 36 0.25 10
　　　F 36 0.125 10
　 对照Ⅰ 36 10
　 对照Ⅱ 36 4
4.1.1.2.植入物的制备:按Urist的方法[92]，从新鲜小牛骨中提取bBMP，获部分纯的bBMP，自然干燥。经小鼠肌袋植入实验证实其活性。取适量牛松质骨，切成3mm×3mm×3mm骨粒，经脱脂，脱蛋白等处理去除其抗原性，再部分脱钙、水洗、冻干[105-107]。修剪成每粒10±0.1mg。测钙含量1.9～2.2μg/10mg(牛松质骨)。扫描电镜观察骨孔径350～500μm，孔率为70％，根据实验分组(表4-1)，计算各组所需骨粒总数及bBMP的毫克。共分为8个组，各组样本数均为36个。在A至F组，各组每颗骨粒所含bBMP依次为4mg(A组)，2mg(B组)，1mg(C组)，0.5mg(D组)，0.25mg(E组)，0.125mg(F组)。对照I为单独松质骨粒，对照Ⅱ为单独bBMP4mg。采用已报告的类似方法，将bBMP溶于适量的4M盐酸胍/0.05M氯化钙液中，再将骨粒投入，混匀，真空排气15分钟，装袋对水透析24小时，4℃。冻干后分装，环氧乙烷消毒，备用。
取A组样品扫描电镜观察，松质骨在结合bBMP后呈实体性疏松绒毛，网状结构，骨孔也填充絮网状bBMP(图4-1)。
　　4.1.1.3.动物分组及处理
　　取封闭群昆明小鼠288只，均为雄性，体重20～22g，随机分入上述8个实验组组。无菌手术，将一块骨粒植入小鼠股部的肌间隙内，对照Ⅱ植入bBMP自然干燥品4mg。术后维持相同条件饲养。各组于术后7、14、21天处死12只，12只，12只，每组每次取6块标本做组织学检查，其余组织块用于生化学检查(表4-1)。
　　4.1.1.4.检查项目及方法
　　a.组织学检查与图象分析:取材后将标本置于10％中性甲醛中固定12～24小时，然后置复合脱钙液24小时，水洗、脱水、石蜡包埋，制备4ｕm连续性切片，行HE染色和三色染色，光镜下观察并做计算机辅助图象分析[50,75,98,103]。计算机主机为SMD 486/110V微机，内存4M，硬盘250M；图像采集卡为清华大学电子系华业公司MICROSUN-90型512X512，8BIT双帧伪彩色图像采集卡；图像监示器为CASPER 5157微机数模两用彩色监示器；摄像机为STORE-CCD彩色摄像头(PAL-D制，580线)；软件采用美国Iamge-Pro V1.6图像处理软件包。将三色染色切片置于体视学显微镜视野内，放大12倍，接通摄像系统，使待测的骨块截面全部收集入视野，仔细调焦，标定尺度，于显示器荧光屏上定格，用鼠标器沿骨块截面周边扫描，周边的新骨也同时计入，作为该张切片上骨性组织总面积。再用同样方法逐一扫描，合计切片上所有新生骨性组织的总面积(包括骨髓、类骨)重复此程序，逐一测量各张切片，结果输入微机进行统计学分析，以百分比表示各组的成骨量[34,46,103]。

新骨面积(mm2)
成骨量％＝ X 100％
　　　 　 　骨块截面(mm2)＋骨块周边新骨(mm2)
　　b. 碱性磷酸酶(ALP)测定:按文献报告的方法[73]加以改进。取材后清除标本表面的肌肉，称重，置入玻璃匀浆器中，加入2ml生理盐水，匀浆，离心，10000rpm，10分钟。取上清测ALP活性。以对硝基苯磷酸钠为反应底物。于Beckman　Du-7分光光度仪上，410nm比色。以水调零，获读数后查标准曲线，并将数值换算成国际单位，再以标本湿重(mg)为除数，即得ALP的国际单位(U)/mg组织(湿重)。
　　c.钙含量测定:取上述离心沉淀物用盐酸消化，用原子吸收分光光度仪(Hitachi-7500)测定钙含量，也以标本重量(mg)为除数，得出标本钙量μg/mg组织(湿重)。
　　采用方差分析做统计学分析。观察不同时间点时各实验组与对照Ⅰ相比是否有显著差异，并进一步做组内两两比较。
4.1.2.　结果
　 4.1.2.1.组织学检查及图象分析:
　　(表4-2)示组织学检查及图象分析结果:
⑴术后7天时，在A～D组可见大量梭形细胞及肥大的间充质细胞增殖，环绕并分散于骨块之内。但只有A组及对照Ⅱ有典型软骨细胞形成(图4-2)。对照Ⅰ只有少量亚急性炎细胞。
⑵14天时，A～C组有软骨、类骨形成及软骨钙化，呈弥漫灶性分布。D.E组只有稀疏小软骨岛分布。对照Ⅱ形成的软骨主要位于原植入的bBMP团块周围，中心部位均质，淡染，无细胞成分。
⑶21天时，A组和B组新生软骨融合成蜿延迂曲的骨小梁，还可见板层骨和新生骨髓(图4-3)，部分原植骨吸收替代。C.D.E组21天时只有散在小软骨岛，未见骨髓形成。F组骨块骨孔中有纤维组织增生。对照Ⅰ骨块周围纤维组织包膜形成。
⑷对照Ⅱ21天时，原bBMP团块周围的“壳”状软骨层形成板层状骨和骨髓(图4-4，4-5)。
⑸21天时成骨量图象分析结果显示，A组的成骨量是单独植入同剂量bBMP时的2倍(表4-2)，p＜0.05。各组成骨量随bBMP量减少而减少。
　4.1.2.2.ALP测定结果
　　ALP测定结果见(表4-3，图4-6)
⑴7天时，A～F组ALP水平与对照Ⅰ相比无显著差异，但对照ⅡALP水平则大于其余各组，p＜0.05
⑵14天时，A～D组ALP水平已升高，与对照Ⅰ相比有显著差异，p＜0.05，两两比较发现A～D组间差异显著，p＜0.05。
⑶14天时，对照ⅡALP水平显著高于A～C组。p＜0.05。
⑷21天时，在A～F组，其ALP水平与14天时相比略升高，并仍显著高于对照Ⅰ，p＜0.05。各组ALP水平随bBMP剂量的递减而递减(图4-6)，两两比较在A～C组间有显著差异，而对照ⅡALP水平则陡降(图4-6)。
　4.1.2.3.钙量测定结果
　　钙量测定结果见(表4-3)。
⑴7天时，A、B组钙量大于对照Ⅰ，p＜0.05。
⑵14天时，A～D组钙量大于对照Ⅰ，p＜0.05。各组钙量也随bBMP剂量的减少而递减，两两比较，p＜0.05。
⑶21天时A～F组钙量大于对照Ⅰ，各组钙量仍存在梯度差，p＜0.05。并且A～F组钙含量较14天时继续升高。
⑷对照Ⅱ组钙量14天时开始升高，21天时略有降低，P＜0.05(图4-6，表4-3)。
　4.1.3.　小结
　　目前对成骨因子诱导成骨机理的研究不断深入，而bBMP的临床应用也已取得可喜的开端，但由于动物骨来源的BMP提取困难，获取量少、价昂，使其大规模的研究及应用受到一定限制，了解获满意成骨效应的最小BMP剂量，是各国学者极关注的问题[94-96]。同时，对各种成骨因子深入的研究及其复合植骨材料的不断涌现，也对成骨活性的分析提出了更高要求，单纯定性的研究已远远不能满足需要。因此，定量地评价各种成骨因子及其复合植骨材料(不同种属、来源、纯度、剂量及载体等)的诱导成骨能力，已成为一项有重要价值的工作[50,53,94-96]。
　　本实验利用多指标的观察，对bBMP含量不同的RBX诱导成骨能力进行了定量性研究。结果发现:
⑴RBX的诱导成骨力与其所含的bBMP呈剂量依赖性关系，表现为标本中的钙含量，ALP水平及组织学成骨量与bBMP剂量呈正相关。0.125mgbBMP/10mg牛松质骨(F组)为诱导成骨的下限。我们以此做为RBX人体应用时计算等效剂量的参考。当每10mg松质骨中bBMP含量为0.125mg时，镜下无可见的新骨形成，但其钙量及ALP水平却还是大于对照Ⅰ，该现象值得进一步研究。
⑵单独植入4mgbBMP时，7天时ALP水平大于RBX组，14天时已显著高于A～F组，但21天时却陡降，小于A组～F组，提示其诱导成骨能力已减弱，对照其组织学所见，14天时bBMP植入物周围形成一层新生骨包壳(图4-4，4-5)，21天时该骨壳转化为板层并有骨髓样组织，但成骨量及钙含量(表4-2，4-3)并未增加。结果提示BMP应采用适当的分散形式(如与载体结合)增加与靶细胞的接触，以充分发挥作用[60,61]。
⑶Deles研究地质学提出的理论[18]，从一块岩石随机切取一个横断面，它含某成分的面积分数即等于该成分在整块岩石中的体积分数。从骨组织之切片中计数的某一面积，也近似等于该成分的体积。当新生骨面积占切片相关组织总截面积的20%时，即为C+2级成骨效应[50,75,98,103]。本实验中图象分析显示，21天时，对照Ⅱ成骨量为30％，属C+2级成骨，文献介绍[34]: 1BMP活性单位＝产生C+2级异位成骨效应所需的最小BMP剂量。故认为本实验所用bBMP为每4mg为1活性单位(植入2mg和3mgbBMP时未达C+2，结果未列入本文)。仅就BMP而言，相同方法不同时间及批次提取的产品，重量相同而活性却可能有差异，因此，用活性单位而不是重量来表示BMP的剂量似更为客观。本实验显示ALP，Ca含量，图像分析结果变化趋势一致，实验采用的骨定量方法较为可靠。鼠标扫描时，应同时在光镜下对比观察，以免遗漏新骨。