成纤维细胞生长因子增强骨形态发生蛋白在小鼠体内骨诱导作用
李亚非 等

摘要 在啮类动物体内植入骨形态发生蛋白(BMP)后，引起细胞内一系列生化和形态学变化，在植入物内和其周围形成新骨。这过程受多因素影响。本实验将重组人成纤维细胞生长因子(bFGF)与部分纯化的牛BMP悬液混合后注入小鼠肌肉，观察成骨反应。单独注射牛骨BMP组和bFGF组为对照。21天时在bBMP/bFGF组及单独bBMP组均有新骨形成，但bBMP/bFGF组的钙量是单独bBMP组的３倍(P<0.01)并有较明显的血管增生现象。

关键词：成纤维细胞生长因子，骨诱导，骨形态发生蛋白

作者单位：710032
西安市，第四军医大学
西京医院骨科研究所
骨形态发生蛋白(BMP)具有吸引和诱导间充质细胞分化成软骨的作用，并进一步通过软骨内化骨转化为骨组织。这种机制的骨诱导在骨骺成骨和骨折愈合过程中是近似的。由经BMP发动的这个过程一旦开始，即有多种生长因子参与并调节 。体外实验证实硷性成纤维细胞生长因子(bFGF)，有刺激软骨细胞增殖作用 。它是在骨基质中发现的生长因子之一。FGF还是一种强大的毛细血管增殖刺激剂 ，而软骨内成骨和毛细血管形成是骨诱导刺激后成骨的重要步骤。所以我们将重组人bFGF与bBMP悬液注入小鼠肌肉内，３周后检测组织学反应及钙含量，观察bFGF对BMP的诱导成骨作用是否有加强。

材料和方法
按文献报告的方法从新鲜小牛皮质骨中提取部分纯化的bBMP 。经小鼠肌袋植入实验证实其高度骨诱导活性。96mg bBMP溶于24ml6M尿素溶液，对水透析24小时，4℃, 得bBMP混悬液平均装入24个安瓿。冻干，封口备用。重组人bFGF为冻干品（Synergen,Boulder,CO.U.s.A.）。
48只昆明种小鼠，雄性，体重25克。随机分为４组。Ａ组：用含bFGF100ng的PBS液0.3ml(PH7.2)，注入含bBMP4mg的安瓿中，使成混悬液，吸入皮试注射器，注射入小鼠股部肌肉内。Ｂ组：bBMP4mg/PBS液0.3ml混悬液注入小鼠股部肌肉。Ｃ组：bFGF100ng/PBS液0.3ml。Ｄ组：PBS液0.3ml。均同法注射。
21天时处死小鼠，切取注射部位的组织。每组的６份标本用10%中性福尔马林固定，盐酸脱钙24小时，水洗、脱水、石腊包埋，切片，HE染色，光镜下观察。各组另外６份标本用作钙含量测定。清除标本表面肌肉、匀浆，以10,000rpm离心，沉淀物用盐酸消化，于原子吸收分光光度计测定钙含量，作为成骨定量的指标 。

结果
21天时，Ａ组小鼠注射侧股部肌肉内可触及一骨性硬结，体积明显大于Ｂ组。组织学检查镜下可见，Ａ组有板层骨，骨小梁和红骨髓形成，间有纤维组织（图１）。在新骨周围软组织中有毛细血管组织（图１）。Ｂ组也有新骨形成（图２），但未见新生毛细血管，Ｃ组和Ｄ组未见新骨。但Ｃ组有纤维组织增生（图３）。
钙含量测定，单纯注射bFGF组与注射PBS组钙量无显著差异（表）。bFGF/bBMP注射组(A组)的钙含量是单纯bBMP注射组（Ｂ组）的３倍(P<0.01)，并且是单纯注射bFGF组（Ｃ组）的８倍。Ｂ组钙含量也大于Ｃ、Ｄ组。

讨论
我们的实验结果显示，将bFGF加入bBMP悬液内注射入小鼠肌肉内，可显著增加bBMP的诱导成骨量。
在对人胫骨骨不连组织超微结构研究发现 ，软骨细胞的结构和功能似乎是正常的，但组织中血管数量少，栓塞形成，认为骨不连组织是有矿化能力的，但缺乏运输足量钙质的血供，是骨不连的真正原因。
FGF是一种最初在脑组织和垂体中发现的
蛋白质，进一步发现在其它组织也广泛分布，对胚胎发育及软、硬组织损伤修复过程中起重要作用 ，促进毛细血管、成纤维细胞迅速增殖 。FGF还可由软骨细胞及其前质形成，并刺激未成熟的软骨细胞或其前质的增生，从而间接调节软骨细胞的分化和软骨基质的出现 。Aspenberg等 ，将人重组bFGF加入异体骨基质植入小鼠体内，结果显示新骨的形成量显著高于对照组。
本实验中bFGF所影响的细胞机制尚不清楚,但由于体外实验中软骨细胞可以受FGF刺激而分化增殖 ,FGF又是一种强大的毛细血管增殖刺激剂，本实验中观察到Ａ组新骨形成伴明显血管增生现象，成骨量大于Ｂ组。所以，bFGF可能是促进了bBMP诱发的需要血供的软骨内化骨。
近期的研究认为，骨修复是一个有多种生长因子参与并调节的过程 ，含有多种骨诱导因子并与适宜载体结合的移植物在骨科临床具有广阔前景。本实验结果提示⑴外源性血管增殖因子bFGF与bBMP复合植入小鼠肌内，在多种内源性生长因子存在下，增强了异位成骨。⑵骨愈合过程还可能受其它多种外源性生长因子影响。⑶含有血管增殖因子FGF的骨诱导物，可能会促进某些血运不良的骨愈合。

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