兔骨痂中骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子基因表达的免疫组化研究
李亚非 李 青 马福成 陈万录 刘新平

摘要
目的：了解骨形态发生蛋白(BMP)与硷性成纤维细胞生长因子(bFGF) 在兔桡骨骨折骨缺损骨痂中的表达强度,及其与骨愈合预后的关系。
材料与方法: 制做兔桡骨骨折和骨缺损模型,于术后2,12周处死取材,X线拍片,标本制备石蜡切片,利用骨形态发生蛋白(BMP)和硷性成纤维细胞生长因子(bFGF)多克隆抗体对骨痂进行了免疫组化研究。
结果：骨折骨痂中2周时BMP与bFGF表达强阳性,12周时表达减弱,最终骨折愈合。 骨缺损组织2,12周时BPM与bFGF表达均为阴性,最终骨不连。
结论: BMP与bFGF骨折后初期及晚期的低表达与骨不连有关,骨折断端补充外源性生长因子可能会促进骨折愈合。
关键词：骨折愈合 免疫组化 成纤维细胞生长因子，骨形态发生蛋白
作者单位：1. 710032 西安,第四军医大学西京医院骨科研究所, 2. 第四军医大学病理解剖教研室, 3.第四军医大学生化教研室

骨断端成骨细胞活性及血液循环状态与骨折愈合预后密切相关。BMP和bFGF有促进成骨细胞增殖及毛细血管生成作用。 目前未见这两种骨生长因子在骨痂中的表达状态和与骨折愈合预后关系的报告。我们利用BMP 多克隆抗体与bFGF多克隆抗体,研究了兔骨折骨痂和骨缺损骨痂中BMP与FGF基因表达,以探索骨不连的发生与BMP和FGF基因表达间的关系。

材料与方法
1.主要试剂:BMP多克隆抗体由第四军医大学全军分子生物学实验室提供, 为抗BMP2A基因表达产物的兔免疫血清,浓度为1:50。bFGF多克隆抗体(Sigma公司) 为抗bFGF基因表达产物的牛免疫血清，浓度为1:60。ABC试剂盒
2.动物模型及标本的制备:新西兰兔16只,手术造成左侧桡骨中1/3 长2mm缺损(利用牙科电钻),右侧桡骨中段15mm缺损,常规切除骨膜封闭髓腔。术后分笼饲养。 于术后2,12周分别处死8,8只,取下双侧尺桡骨, X线拍片, Bouins液固定24小时, 置于15%EDTA溶液中脱钙, 4℃, 每周换EDTA液一次, 6周后结束脱钙。 水洗标本过夜。石蜡包埋，制备5um切片, HE染色, 光镜下观察。
3.免疫组化实验:常规切片经脱蜡至水后, 分别经甲醇─双氧水封闭内源酶, 10%正常羊血清封闭非特异染色。按常规ABC法进行免疫组化染色。切片经第一抗体(BMP与bFGF多克隆抗体)处理过夜, 室温, 依次经生物素化第二抗体。ABC复合物处理30分钟, DAB显色。用磷酸盐缓冲液(PBS)或兔(牛)非免疫血清替代一抗作为阴性对照,人毛血管瘤和骨肉瘤组织切片作为阳性对照。
结果
一、Ｘ线片及HE染色切片: 术后两周时, 桡骨骨折间隙少量新骨形成，而骨缺损区无新骨。术后12周时，桡骨骨折断端有较多骨痂，断端连续，而桡骨缺损区仍无新骨形成(图1)。HE染色切片显示骨折端15周时大量新骨形成，12周时达骨愈合，有皮质及髓腔形成。骨缺损2周时断端少量新骨, 缺损区为纤维结缔组织填充。 12周骨缺损区仍无新骨，断端骨有吸收。
二、免疫组化研究结果：术后两周时，桡骨骨折骨痂BMP染色强阳性， 尤以新骨骨基质，骨母细胞，骨细胞为明显，但未骨化的肥大软骨细胞为阴性（图２）。bFGF阳性的组织细胞及强度与BMP染色相同（图３）。术后12周骨缺损区,仅紧邻断端的区域有BMP及FGF染色弱阳性,缺损区纤维组织BMP与FGF染色均为阴性(图4), 12周时,骨折骨痂改建,仍有BMP与FGF染色阳性,但强度明显减弱(图5,6), 骨缺损组织二者染色均为阴性。

讨论
骨不连的确切发生机制仍不够完全明了, 但已明确骨不连组织血循环结构与功能均不正常,并使成骨细胞活性因此受影响(1), 骨修复是一个多种骨生长因子参与并和局部血循环状态密切相关的过程(2)。BMP有较强的骨诱导能力, 临床及实验研究中已用来促进骨折修复(3), bFGF 则具有刺激毛细血管内皮细胞和成骨细胞分化增殖作用(4,5)。 但这两种生长因子在骨不连组织中的表达状态及其与骨折愈合预后的关系,也尚不够清楚。
本实验研究显示,在兔桡骨骨折骨痂中含有丰富的BMP和bFGF, 在骨折修复初期的2周时,在新生骨基质,骨母细胞中,BMP与bFGF染色均为强阳性,而在12周改建期的骨痂中,BMP与bFGF表达减弱,最终均骨愈合。在兔桡骨缺损骨痂中,仅与骨断端紧邻的区域有微弱BMP和bFGF表达,最终骨不连。结果提示BMP与bFGF 在骨折修复早期对新骨的形成与发展有重要影响,骨痂中这两种生长因子的缺乏,可能是骨不连的原因之一。实验结果还为应用外源性生长因子促进骨折与骨不连愈合提供了理论上的依据。实验中还发现,BMP与bFGF阳性染色主要位于新骨骨化前沿区, 而肥大的软骨细胞染色却为阴性,对于这种现象还需进一步研究。