碱性成纤维细胞生长因子增强兔脱钙骨基质的成骨作用
李亚非 李 青 胡蕴玉

摘要
目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与脱钙骨基质(DBM)混合物植入兔背肌间隙后DBM诱导面骨及新骨替代是否增强。
材料与方法:将bFGF与兔DBM混合(bFGF 2ug/1g 湿DMP)、冻干、装明胶囊、 辐射灭菌。单独DBM作为对照。植入兔骶棘肌间隙。术后1,2,4周取材。进行组织学检查并测定标本的硷性磷酸酶活性及钙含量。
结果: 1周时bFGF/DBM组诱导大量软骨细胞形成,而对照组2 周时才有少量软骨细胞出现。4周时bFGF/DBM组大量新骨形成,软骨细胞少见,对照组软骨细胞数量虽然bFGF
/DBM组大量新骨形成,软骨细胞少见,对照组软骨细胞数量虽然bFGF/DBM组多, 但新骨明显至少。1,2,4周时bFGF/DBM组ACP活性及钙含量均显著高于对照组。
结论: bFGF早期促进DBM软骨细胞形成,晚期加速DBM新骨替代过程。

为了解外源性bFGF在DBM骨诱导过程中的作用,本实验将基因重组人bFGF 与兔DBM混合后植入兔骶棘肌间隙中,观察bFGF是否能增强DBM的骨诱导作用。
材料与方法
取新宰杀的新西兰兔四肢长骨骨干,清除软组织和骨髓,锯成1.0cm长骨段,浸泡于3mM NaN3液,20℃,4小时。用40-50℃水反复冲洗骨段3次,骨段置入0.6N HCl脱钙, 4℃,24-48小时。至骨质柔软、半透明状时结束脱钙。至此骨成为脱钙骨基质(DBM)。再将DBM骨段切成0.2x0.2x0.1cm骨粒,用蒸馏水浸洗DBM骨粒4小时,更换洗液3次,至PH值达6.0为止。
将DBM骨粒控干水分,加入基因重组人bFGF(珠海东大制药公司),bFGF 2ug/1g 温DBM。将bFGF/DBM装入程控冷冻干燥机内,自动程序冻干,将bFGF/DBM骨粒0.8g 装入2号明胶囊,6℃。辐照灭菌,5KGy。未加bFGF的DBM也装入胶囊同时灭菌,作为对照组。
新西兰兔15只,不分雌雄,体重2.5+0.2kg。兔背部脱毛,2% 巴比妥钠静脉麻醉, 于兔腰北部棘突两侧旁开1.0cm,每侧做上、下两纵切口,相距3cm。锁性分离骶棘肌造成四个肌穴。将bFGF/DBM胶囊一粒植入左上或右下肌穴,将DBM胶囊一粒植入右上和左下肌穴,分层缝合肌肉,盘膜及皮肤切口,术后兔随机分为3组,分笼饲养。 分别于术后1,2,4周,处于5,5,5只。
取材时将DBM植入区的结节连同周围少量肌肉一同切下,清除结节表面肌肉, 用锐刀将其均分成两份标本,一份置入10%福尔马林液24小时。0.6N HCl脱鲈, 按常规方法制备石蜡切片HE染色。另一份先称重,然后匀浆,离心10000rpm/分,取沉淀物用盐酸消化,用原子吸收分光光度计测定钙含量(ug/mg组织湿重)。离心上清液以对硝基酚法测定硷性磷酸酶含量(U/mg组织湿重)(1)。

结果
一、组织学检查结果:
bFGF/植入后1周,在骨粒表层及骨粒间隙中有大量新生软骨细胞增殖(图1),2周时软骨面积继续扩大,部分新生软骨融合,钙化成新骨,原植骨开始被替代、吸收。4周时新生软骨完全转化为密集的新骨罗软骨细胞已很少见到,小梁骨形成。 新骨表面排列密集的立方状骨母细胞(图2),并有毛细血管及骨髓形成。对照组DBM1周时未发现新生软骨,2周时可见少量软骨细胞,4周时偶见散在新生小软骨岛,DBM仍为死骨( 图3)。

二、钙含量及ALP测定结果
显示在植入后1,2,4周时,bFGF/0.8M组的ALP活性和钙含量均大于对照组。
测定结果见附表,经统计学分析,两组间及组内不同时间点数值有显著差异, P< 0.01。

讨论
实验结果显示,bFGF/DBM组成骨量显著高于对照组。
实验研究发现,bFGF对很多属的成骨细胞及其前质细胞都有刺激增殖作用(2), 在骨折早期的骨痂中,发现了bFGF,TGFβ,BMP,PDGF等多种生长因子的mRNA表达(3),说明bFGF与其它骨生长因子一起参与骨修复过程。bFGF的另一重要作用是促进毛细血管内皮细胞增殖,形成毛细血管芽(4)。bFGF还促进纤溶酶原激活物和胶原酶分泌, 降解损伤区的细胞外基质,使毛细血管向创伤区长入,提供营养。对人胫骨骨不连组织的超微结构研究发现,毛细血管的减少、损伤、 缺乏运输足量钙质的血供是骨不连的真正原因(5)。DBM异体骨等移植后以软骨化骨形式新骨替代, 其速度与程度取闪于新毛细血管长入的速度和深度。 骨移植后, 骨块与宿主受体之间隙局部输注bFGF,使毛细血管长入的时间提前,长入深度增加(6)。
本实验发现,bFGF/DBM组1周时标本中软骨细胞数量,ALP活性及钙含量均显著高于对照组。而4周时虽然bFGF/DBM组的软骨细胞数量比对照组少,钙含量、ALP 活性及组织学成骨却高于对照组,提示bFGF可能刺激了与软骨细胞分化的细胞机制,早期促进软骨形成,晚期加速新骨替代(7)。可能与bFGF在移植物中造成了较多的适合软骨岛形成的位点有关,组织学检查也确实见到了bFGF/DBM组有较多的软骨岛散布于DBM骨粒间隙及DBM表层。实验结果提示,含有bFGF等外源性骨生长因子的骨移植物, 其成骨、新骨替代,血运重建过程可能会得以加速。

附表 ALP与钙含量测定结果
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ALP(U/mg组织湿重) 钙含量(ug/mg组织湿重)
植入物 ───────── ───────────
1周 2周 4周 1周 2周 3周
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bFGF/DBM 0.31* 0.65* 0.92* 12.20* 25.71* 60.06*
DBM 0.11 0.28 0.37 3.30 5.21 8.32
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参考文献

1. Schwarz N, Diges HP, Schiesser A, et al. Dog bone less osteogenetic than rat bone. Acta Orthop Scand, 1989,60(6):693
2. Gospodarowicz D. Fibroblast growth factor. Clin Orthop 1990;257:231
3. Bolander ME. Regulation of fracture repair by growth factors. Proc Sco Exp Biol Med 1992;200(2):165
4. Hom DB, Maisel RH. Angiogenic growth factors: Three effects and potential in soft tissue wound heaing. Ann Otol Rhinol Laryngol 1992; 101: 349
5. Guacci D.Ultrastructural aspects of human nonunion. Histo Histopathol 
1991;6:87
6. Eppley BL, Doucet M, Connolly D, et al. Enhancement of angiogenesis by β-FGF in mandibular bone graft healing in the rabbit. J oral Maxillofac Surg 1988;46:391
7. Aspenberg P, Lohmander S. Fibroblast growth factor stimulates bone formation. Acta Orthop Scand 1989;60:d482