人骨折骨痂中转化生长因子β1的免疫组化研究
李亚非 李青 陈万录 Lars Grimelius 胡蕴玉

摘　要:为了解转化生长因子β1(TGF—β1)在人骨折骨痂中的细胞定位,表达强度及其与骨折修复的关系,采用不同修复阶段的人骨折骨痂组织切片，以TGF—β1抗体进行免疫组化研究。结果发现:成骨细胞、新骨骨基质、修复中的关节软骨细胞中TGF—β1染色强阳性,肥大的软骨细胞染色阴性。改建期骨破骨细胞染色阳性。染色强度在14天至262天中逐渐减弱。骨不连组织TGF—β1染色阴性。TGF—β1可能由人成骨细胞合成并分泌入基质,并自骨折后的较早期直至改建期持续发挥重要作用。

关键词：转化生长因子β，骨折愈合，免疫组织化学，人

TGF—β是一种对结缔组织细胞有多种功能的调节因子。TGF—β也存在于骨基质中，并可由骨和软骨细胞产生，还可由血小板或巨噬细胞释放,对软、硬组织损伤的修复有重要调节作用。本实验采用免疫组化的方法，对人骨折骨痂中TGF—β1的细胞定位及表达强度进行了研究。

材料与方法
一、标本
骨痂标本为手术时取自骨折后7～262天的骨断端。骨折后14～ 40天组织学属于2阶段(附表)9例,其中肱骨干骨折3例,股骨干骨折2例,胫骨干骨折2例 ,股骨干骨折2例。骨折后110～262天组织学属于3阶段(附表)8例,其中肱骨干骨折1例, 股骨干骨折3例,胫骨干骨折2例,股骨髁骨折1例,桡骨干骨折1例。3例为组织学属于1阶段(附表)骨折后120～174天骨不连的骨痂,股骨干骨折1例,胫骨干骨折1例 ,股骨颈骨折1例。标本置入10%中性福尔马林液中浸泡48小时,4℃。用骨刀切成5mmx5mmx3mm小块，将骨块置入10% EDTA液(pH7.2)脱钙[1]，4℃，每周换脱钙液1次。待用针可刺入骨皮质时停止脱钙，约需30～40天(皮质骨)，或20天(软骨痂)。随后石蜡包埋(60℃)，制备4μm切片。
二、主要试剂
TGF—β1抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)为兔抗人TGF—β1抗体,由瑞典Uppsala大学医学院内分泌病理研究所Dr.Grimelius L提供。工作浓度为1: 100 。ABC试剂盒为博士德公司产品。其它试剂均采用分析纯。
三、免疫组化研究
切片经脱蜡至水后，分别经甲醇双氧水封闭内源酶，正常血清封闭非特性染色。最后按常规ABC法进行免疫组化染色。即切片经第一抗体(TGF-β1多克隆抗体)处理过夜后，依次经生物素化第二抗体、ABC复合物处理30分钟，DAB显色。用PBS 或兔非免疫血清代替一抗作为阴性对照,毛细血管瘤组织切片为阳性对照。

结 果

由于同一张人骨折骨痂切片常可见多种成分,如血管,纤维组织，板层骨或改建中的骨,钙化或未钙化的软骨,而且染色阳性与否主要与骨愈合的组织学特点( 而不是时间)相关,为此按所观察到的占优势的主要成份将其分阶段(附表)。在表现为2 阶段(附表)的标本，14天时正在增殖中的小软骨细胞TGF—β1染色阳性，肥大的软骨细胞TGF—β1染色阴性，而融合、钙化并转变为新骨的软骨及其表面的成骨细胞，TGF—β1染色强阳性(图1)，小血管管壁也为阳性。28天的标本中，TGF—β1 阳性组织主要为新骨表面的成骨细胞，而骨小梁间的纤维组织也表现为阳性。
在3阶段(附表)110天的标本，改建中的新骨表面成骨细胞TGF—β1染色阳性(图2)，但强度已降低。3阶段(附表)262天标本显示骨陷窝成骨细胞和破骨细胞染色阳性(图3)。在股骨髁骨折，关节软骨面畸形愈合249天的1例， 取畸形愈合处软骨面检查，发现关节软骨细胞TGF—β1染色强阳性(图4)，而正常软骨为阴性或弱阳性。
在组织学1阶段(附表)的标本(骨不连)， 骨痂组织中主要成份为纤维结缔组织及肉芽组织，未见新骨,TGF—β1阴性。

附表　骨痂的组织学分阶段
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　阶段　　　　组织学所见
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　1　　　　纤维结缔组织、肉芽组织，无新生
　　　　　 软骨或骨，临床确诊为骨不连

　2　　　　新骨或软骨或两者共存，尚未发生
　　　　　 改建
　3　　　　编织骨或板层骨，伴或不伴有残余
　　　　　 软骨。活跃的骨改建
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讨　论

TGF—β是一种对多种类型结缔组织细胞具有复杂生物学效应的生长因子[ 2] 。TGF—β对细胞的分化和增殖可能有抑制或刺激作用。TGF—β1 由受损组织中活化的巨噬细胞中释放出来并控制组织修复。近年来发现TGF —β具有调节骨修复的作用[3]，利用小鼠骨折模型发现TGF—β表达于增殖的间充质细胞、成骨细胞和小软骨细胞。肥大的软骨细胞则缺乏TGF—β1的表达[3]，其周围的新骨基质却可有TGF—β1的表达，对人骨折骨痂分子原位杂交显示，上述细胞中有TGF—β1mRNA表达[4]。但未见采用免疫组化方法研究人骨折组织中TGF—β1的报告， 虽有人采用分子原位杂交的方法，对TGF—β1基因表达的细胞定位，但由于TGF—β1胞内和胞外的生物学过程是很复杂的，所以尚需结合免疫组化的方法研究[4]。
我们采用免疫组化的方法研究了TGF—β1在人骨折组织中的定位及表达状态，标本为畸形愈合的骨痂或骨不连组织。观察发现，在2～3阶段的标本,2周时新骨的成骨细胞TGF—β1阳性，28天时达高峰，甚至骨小梁间的纤维性组织为阳性。180天、262天这些细胞仍为阳性，但强度减弱。改建期骨破骨细胞染色阳性。提示TGF—β可由上述细胞产生，并在新骨形成、改建过程中，较长时间地参与骨修复。骨不连组织中，TGF—β1表达阴性，也证实了TGF—β1对骨修复的重要性，TGF—β1的低表达或许是骨不连原因之一，但其原因尚待进一步研究。实验中还发现损伤关节软骨面的修复过程中，软骨细胞TGF—β1表达阳性，提示TGF—β1还参与受损关节软骨的修复过程。由于这种现象多见于活跃的骨化区，可能是骨基质中含有来自成骨细胞的TGF—β1，也说明进行活跃成骨活动的成骨细胞有较强的TGF—β1合成能力。结合其它的动物实验及人骨痂原位杂交研究结果，实验结果支持局部生成的TGF —β1在骨修复中的重要作用。

参考文献

1 Bourque WT, Gross M, Hall BK. A histologicl processing technique that preserves the integrity of calcified tissues (bones, enamel), yolky amphibian embryos, and growth factor antigens in skeletal tissue. J Histochem Cytochem, 1993,41:1994.
2 Hoyland JA, Thom JT, Donn R, et al. Distribution of type X collagen mRNA in normal and osteoarthritic human cartilage. Bone Miner, 1991,15:151.
3 Joyce ME, Jingushi S, Bolander ME. Transforming growth factor-beta in the regulation of fracture repair. Orthop Clin North Am, 1990,21: 199.
4 Andrew JG, Hoyland J, Andrew SM, et al. Demonstration of TGF-β1 mRNA by in situ hybridization in normal human fracture healing. Calcif Tissue Int, 1993,52:74.