人骨折骨痂中胰岛素样生长因子Ⅰ的免疫组化研究
李亚非 李青 马福成

摘 要

目的: 了解胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)在人骨折骨痂中的细胞定位及表达强度, 与骨折愈合的关系。
材料与方法：利用不同修复阶段的人骨折骨痂，以IGF-Ⅰ单克隆抗体进行免疫组化研究。
结果：在软骨和骨形成阶段，成骨细胞、非肥砺生软骨细胞以及新骨基质IGF-Ⅰ表达阳性。在骨改建阶段，成骨细胞、骨小梁间隙中结缔组织、血管壁阳性，但强度随时间处长逐渐减弱。
结论：实验结果提示ＩＧＦ是人骨折愈合过程中的重要局部调节因子。
关键词：胰岛素样生长因子，骨折，免疫组织化学

作者单位：1. 710032, 西安市, 第四军医大学西京医院骨科研究所
2. 第四军医大学基础部病理学教研室

近年来研究发现ＩＧＦ对骨折修复有重要作用，但ＩＧＦ在人骨折骨痂的表达状况的直接研究则很少。本实验采用IGF-Ⅰ单克隆抗体研究IGF-Ⅰ在人骨折骨痂中的表达状态。

材料与方法
1、标本:17例骨痂标本为手术时取自骨折后7—262天的骨断端。这些患者经保守治疗断端已发生畸形愈合。3例为骨折后骨不连的骨痂(表1)。标本置入10%中性福尔马林液中浸泡48小时，4℃,用骨刀切成5x5x3mm小块，将骨块置入10%EDTA液(pH7.2)脱钙(1)，4℃，每周换脱钙液1次。待用针可刺入骨皮质时停止脱钙，约需30—40天(皮质骨)，或20天(软骨痂)。随后石蜡包埋(60℃)，制备4um切片。
2、主要试剂:兔抗人IGF—1抗体(Sweden)。 工作浓度为1:125, ABC试剂盒为博士伦公司产品。其它试剂均采用分析纯。
3、免疫组化研究
切片经脱蜡至水后，分别经甲醇～双氧水封闭内源酶， 正常血清封闭非特性染色。最后按常规ABC法进行免疫组化染色。即切片经第一抗体(IGF-1多克隆抗体)处理过夜后，依次经生物素化第二抗体、ABC复合物处理30分钟，DAB显色。用PBS或兔(羊)非免疫血清代替一抗作为阴性对照。

结 果
本实验渺及的患者术后均随访１年以上，骨断端均正常愈合。
在骨折后７天的血肿和崩芽组织中，IGF-Ⅰ染色阴性。而骨折后１０－１６天时软骨痂中，较小的软骨细胞和已转变的新骨表达的成骨细胞为阳性染色，肥大的软骨细胞为染色阴性（图１）。新骨骨基质中IGF-Ⅰ也为阳性染色，而对照组新骨基质未着色。在１例股骨颈骨折１０天的骨痂中，位于骨陷窝中的多核巨细胞和成骨细胞IGF-Ⅰ阳性（图２）。
在４９天时的骨折骨痂中，欠骨已经通过软骨内化骨转变为新骨。骨基质仍有弱阳性染色，而新骨表面与骨陷窝内成骨细胞IGF-Ⅰ仍为强阳性（图３），在骨折后２４７天的骨痂中，新生骨小梁表面的成骨细胞、小梁间隙纤维结缔组织中的梭形细胞，小血管壁，IGF-Ⅰ染色均为阳性（图４）。观察发现，凡是成骨活跃的骨基质及其表面的成骨细胞，甚至其周围的纤维组织、血管，IGF-Ⅰ染色均为阳性。当骨折后２４９天骨改建基本完成时，IGF-Ⅰ在骨孔内成骨细胞染色仍为阳性，但强度已明显减弱，骨基质内为阴性（图５）。股骨髁关节软骨骨折畸形愈合２４９天标本显示，IGF-Ⅰ染色阳性（图６）。

讨 论
近年不发现IGF可增加人成骨细胞增殖和蛋白合成， 并且是人软骨细胞丝裂原刺激糖蛋白合成(1)，而使IGF受到关注。由于IGF对骨的作用因种属而异， 所以我们选择人骨痂进行研究。而采用免疫组化的方法可以清楚地证实IGF mRNA是否被翻译成了蛋白质。IGF-Ⅰ存在于啮齿类动物痂中未成熟软骨细胞、上皮系细胞、成骨细胞、巨细胞(2)。同时还发现人伤口液体中IGF-Ⅰ的浓度接近血清中的水平(3)。本实验发现IGF-Ⅰ可在间充质细胞、成骨细胞、骨基质中表达。已知人成骨细胞样细胞在体外可产生IGF-Ⅰ和Ⅱ(4)，并对外源性IGF有反应，所以IGF 在体内组织中的表达提示自分泌作用。现以往的研究结果不同(5)，我们在人骨痂中发现了IGF- Ⅰ的表达，并且有较长时间跨度和较广泛的组织分布（成骨细胞、间充质细胞、骨基质、血管组织等）。而骨不连组织中IGF-Ⅰ表达阴性，也证实了IGF 是骨修复过程中的重要调节因子。还有一值得注意的现象，即股骨髁关节软骨骨折２４９天时，IGF-Ⅰ表达阳性，同时在另外的研究中发现（待发表），同一标本TGF-β1、BMPs、bFGF免疫组化染色也为阴性，证实多种骨生长因子，包括IGF- Ⅰ协同参与软骨的修复(6)。
IGFs对骨的作用、IGFs的生成细胞、敏感细胞的表面受体，IGFs与其它生长因子TGFs关系等(6)，对这些问题尚有不同观点，但IGFs 对骨修复有重要作用是无疑的,值得进一步研究。

参考文献

1. McCarthy TL, Centrella M, Canalis E. Regulatory effects of insulin -like growth factors Ⅰand Ⅱ on bone collagen synthesis in rat cavarial cultures. Endicrinology, 1989,124(2):301
2. Bourque WT, Hall BK, Gross M. The role of growth factors in fracture repair using the monse tibia as a model. Prol Znd Conf Int Soc for Fracture Repair, Sept, 1990, P18
3. Spencor ME, Skover G, Hunt TK. Somatomedins: Do they play a pirotal role in wound healing? Prog Clin Biol Res, 1988, 266:103
4. Mohan S, Wergedal JE, Taylor AK. Human osteoblast-like cells produce IGF-Ⅰ and IGF-Ⅰ and IGF-Ⅱ in culture. 1988, Clin Res 36:156A
5. Andrew JG, Hoyland J, Freemont AJ, et al. Insulinlike growth factor gene expression in human fracture callus. Calcified Tissue Int, 1993, 53:97
6. Trippel SB, Wroblewski J, Makower A, et al. Regulation of growth - plate chondrocyte by insulinlike growth factor I and basic fibroblast growth factor. J Bone and Joint Surg, 1993, 75A(2):177