大段异体骨关节移植后组织学、BMP分子原位杂交、免疫组化、Ｘ线片及骨核素扫描的研究
李亚非 等

摘要 

[目的] 观察大段人异体骨关节移植4-65个月后的转归, 包括骨愈合、新骨替代、关节退变。[方法] 取植入4～65个月的大段异体骨关节标本，采用组织学及BMP分子原位杂交及免疫组化方法， 结合随访Ｘ线片及骨核素扫描进行研究。[结果] 发现外骨痂由宿主骨皮质向异体骨皮质侧生长连接愈合,皮质骨爬行替代相当缓慢,5 年时仍大量死骨与活骨共存。异体骨骨松质内可见新骨,骨髓及新生血管,但骨小梁有吸收。非主要负重区的关节软骨细胞部分存活。4 个月时异体骨皮质浅层及骨痂BMP免疫组化染色及分子原位杂交阳性。 植入12个月至65个月骨皮质浅、深层及活骨BMP表达均呈阴性。 [结论] (1)骨痂由自体骨向异体骨侧生长连接以达到骨性愈合。异体骨关节血运可重建。(2)非负重区关节软骨可部分存活。 关节塌陷与骨小梁吸收有关。(3)异体骨内BMP在移植后早期的新骨替代及愈合中起作用,12个月后则主要是靠骨传导而不是骨诱导。(4)坏死骨单位的排除不完全,是异体骨皮质新骨替代慢的原因。 
关键词:骨移植,同种异体骨,免疫组织化学,分子原位杂交

作者对1983年至1997年第四军医大学西京医院骨科和北京军区总医院骨科采用大段异体骨关节修复骨关节缺损后, 由于多种原因在不同时期再取出的骨标本的长期转归进行了观察,共11例。

材料和方法
1.病例:患者的年龄14-75岁,平均29.7岁。男8例,女3例。骨肉瘤4例,滑膜肉瘤1例,骨巨细胞瘤2例,软骨肉瘤2例, 恶性纤维组织细胞瘤1例。均采用肿瘤段切。植入股骨远端半关节3例,股骨近端半关节3例,胫骨近端半关节3例,肱骨近端半关节1例。陈旧性外伤性股骨缺损1例,植入异体股骨干。其中低温深冻骨7例,酒精浸泡骨3例,冻干骨1例。在体内4-65个月,平均22.6个月。感染1例, 发生于酒精浸泡骨。均采用钢板或髓针固定。异体骨关节的长度14-22cm,平均16.1 cm 。 取出的原因,肿瘤复发5例,感染1例,骨不连1例,关节塌陷3例,骨折1例。所有病例植骨后均定期接受Ｘ线拍片，99mTC骨扫描及临床随访。 －80℃冻存骨为无菌条件下取骨，包装并封存( 关节软骨以甘油作为冷冻保护剂)[1,2]。
2.标本处理:异体骨关节取下后，分别由关节软骨端(包括软骨下 骨松质)、骨、异体骨与自体骨连接部取材。标本以10 ％福尔马林固定，0.6N盐酸脱钙，石蜡包埋，制备4um切片，分别行HE、Marsson染色、光镜下观察。
3.植骨的免疫组化研究：取手术取出的异体的骨标本皮质( 植入后4-65个月),切成4x4x4mm,用Bouin液固定48小时，置入15 ％乙二胺 四乙酸三钠溶液中脱钙,4℃,每周换液一次，持续30天完成脱钙。 常规石蜡包埋、每例标本制备4um连续切片多张。BMP多克隆抗体由第四军医大学生化教研室提供，为抗人BMP2A基因表达产物的兔免疫血清，浓度为1:40，ABC试剂盒购自博士德公司。BMP2A质粒由美国基因研究所Dr.Wozney惠赠, 地高辛试剂盒为德 国Boehringer Mannheim Biochemica公司产品。　切片经脱蜡至水后，分别经甲醇～双氧水封闭内源酶，正常血清封闭非特性染色。最后按常规ABC法进行免疫组化染色[3]。即切片经 第一抗体(BMP多克隆抗体)处理过夜后， 依次经生物素化第二抗体、 ABC复合物处理30分钟，DAB显色。用PBS 或兔非免疫血清代替一抗作为阴性对照。以人骨肉瘤组织作阳性对照。
4.原位杂交研究　探针的标记及原位杂交研究程序按地高辛试剂盒说明书进行。标 记时,每微克BMP2A　cDNA片段,分别加入2ul核苷酸六聚体混和液,2uldNTP标记混和液及1ul Klenow酶,充分混匀,37℃反应20小时,最后乙醇收集沉淀。原位杂交时,切片经脱蜡至水后,0.2mol/L盐酸处理及蛋白酶消化,4%多聚甲醛固定30分钟,系列乙醇脱水。加杂交液反应20小时(40℃),依次经2XSSC,1XSSC,0.5XSSC溶液充分洗涤,加地高辛抗体 ,37℃,24-48小时,最后用碱性磷酸酶显色。对照组分别经DNA酶和RNA酶处理。 

结果
一、 骨愈合与骨吸收
在异体骨～宿主骨皮质连接点，X 线检查显示外骨痂主要由宿主骨一侧向异体骨生长延伸，最后与异体骨连接融合(图1)。1例肱骨近 端半关节植入4个月时,植骨与自体骨结合处出2mm 宽Ｘ线透光间隙，且随时间延长变宽，显示骨不连征象。10个月时该例经截除两端断各0.5cm,外固定器加压固定, 4个月后生长骨痂,愈合。 组织学检查显 示，自体骨断端一侧有骨坏死，骨吸收间隙内为肉芽组织, 异体骨断端为死骨，并有明显的骨吸收(图2)。 
二、植骨块的成活替代
4 个月的标本异体骨表面有破骨细胞及间充质细胞及软骨细胞增殖，部分破骨细胞侵入骨质内部，骨表面可形成1～2mm厚的新骨。新骨、骨痂及骨膜BMP免疫组化染色及分子原位杂交阳性(图3)。骨不连标本中,异体骨断端BMP表达阴性。异体骨植入12个至65个月，大量死骨与活骨共存,这些活骨已较成熟,可以见到哈佛氏管和骨板层, 新骨多靠近外骨膜一侧，新骨与死骨互相夹杂，结构紊乱, 其间可见到新生血管。哈佛氏管均有不同程度吸收和扩张, 骨单位的内层已转变为活骨,外层仍为死骨(图4)。皮质骨深部这些替代生成的活骨BMP 表达 均阴性。
核素浓集增强,说明骨再生修复活跃。1例肱骨异体半关节植入者,1年后骨扫描显示植骨区核素浓集强于正常侧,X线片及组织学表现显示异体骨断端明显成骨。另1例股骨上端异体半关节植入者，5年后骨扫描显示植骨区核素浓集弱于正常侧，X线学检查发现股骨头区塌陷。然而1例外伤性股骨干骨缺损,骨不连,植入异体骨干8个月, 骨移植区骨扫描为冷区(图5),但X 线片显示移植骨段两断端与自体骨均已有连续性骨痂形成(图6)。因此,X 线片结合骨同位素扫描估价大段异体骨血运重建复愈合较可靠。 
三、关节软骨成活情况
X线片显示, 在4～65个月的标本中，软骨基质层, 软骨下骨及松质骨结构仍然存在，但松质骨有骨吸收现象，表现为骨小梁变窄，结构稀疏。紧贴关节软骨下的骨小梁有2mm左右宽的密度降低带, 反映骨的吸收与修复活动。36个月内的病例软骨面均无塌陷，而大 于60个月的有1例股骨头的关节软骨塌陷。组织学检查显示， 深冻后植入的关节软骨标本,主要负重区的关节软骨层表面有小凹陷， 软骨层内无软骨细胞，为均质样，但软骨基质的轮廓结构仍存在(图7) ，尽管取骨时都用甘油作为冷冻保护剂处理了关节面，并且置入－80℃ 保存。但在深冻骨非主要负重区有部分活软骨细胞(图8),该区软骨层甚至厚于正常。软骨下层为含有丰富毛细血管的骨样肉芽组织，其深面与骨小梁交界区有新骨，小梁骨较正常为稀疏，显示一定程度的吸收。小梁骨孔内有骨髓样组织及丰富的毛细血管。小梁表面整齐排列 立方状的骨母细胞。小梁骨内有骨细胞，显示小梁已成为活骨(图7)。 观察还发现，关节软骨的退变与断端骨愈合的质量间无显著关系。有的病例断端骨不连形成但关节软骨却只有轻度X线改变， 而另外一些病例断端已达骨愈合,骨干有良好的软组织覆盖,但关节软骨面却出 现了明显的剥脱和塌陷。

讨 论

大段异体骨关节移植在肿瘤保肢治疗及创伤修复中有重要地位,但对其植入后较长时间的转归研究很少[4]。软骨细胞到底能否存活? 新骨替代是骨诱导还是骨传导?尚有不同看法。
我们的观察结果显示,异体骨与宿主骨通常在4-6个月即有坚固外骨痂，少数可半年以上。除了植入骨的制备要求外，局部血运丰富、骨块正确锯裁、骨端准确对位、骨腔紧密充填, 可靠的内固定及术后合理负重，都是重要条件[5,6]。 植骨后骨的吸收与爬行取代是同时进行的，骨吸收可以为骨生长提供新骨爬行掺入的条件。但如果吸收过度超前，植骨吸收过快，导致植骨失败[4,6]。 内锁髓针固定可使断端间隙无法受自身重力加压。所以,以锁住骨干一端为宜,利用体重自加压促进骨愈合。　
骨愈合还与植入骨成骨活性有关[5]。BMP是存在于骨皮质中的骨诱导蛋白，能诱导新骨形成，是骨修复过程中很重要的骨生长因子之一[7]。将外源性BMP掺入异体骨基质中植入可促进骨修复。异体骨中应该含BMP,对骨愈合及皮质骨的爬行替代也应该有重要作用。如骨不 连标本中，异体骨断端BMP表达阴性。植入4个月后的标本, 皮质骨表面新生骨及断端新生骨痂BMP表达阳性。这可能是异体骨所含BMP的骨诱导作用,但也不能排除骨膜的成骨诱发的BMP表达。12-65 个月异体骨皮质深部,包括替代形成的活骨其BMP表达均阴性。BMP 表达阴性有三种可能。一是BMP对温度、pH值、 酶活性等理化因素变化很敏感，极易被降解失活。异体骨经冻融，植入体内后骨皮质深部较长时期内血运不能重建，在某些因素作用下,BMP 很可能已被降解破坏。 二是BMP含量极微,采用的方法不能检测出来。三是一般认为BMP 多在骨修复较早期(2-3周)表达达高峰,此后逐渐减弱。植入12-65 个月表达阴性也可能与其表达高峰已过有关。但大段异体骨植入后其新骨修复替代过程却是长期的,本研究也发现异体骨植入65个月时， 仍大量死骨与活骨共存。此时活骨已较成熟,未见到典型的软骨内化骨现象。 因此大段异体骨关节移植其新骨修复替代过程, 可能主要骨传导而不是骨诱导。但BMP在骨植入后早期仍可能发挥作用,制备骨材时应注意保护其活性。 
本组标本植入骨表层新骨替代后，新骨替代向深部缓慢进行，活骨在皮质骨近外骨膜侧明显多于近髓腔侧,植入后5年的标本也是如此。植骨块的血循环重建程度与骨修复密切相关，血管长入异体骨, 就表示该区域正在进行活跃骨修复。观察发现, 异体骨移植后与自体骨皮质移植不同的是，其坏死骨单位的排除不能达到骨单位的外板层, 形成一个未完全修复的骨单位。这可能是骨皮质长期不能完全新骨替代的原因。上述结果提示, 大段异体骨关节移植其新骨修复替代过程的控制与自体骨膜成骨和血管向异体骨中长入密切相关。其机制尚不清楚,但显然应设法加速这一过程[5]。
本组观察结果显示, 深冻异体骨关节主要负重区关节软骨未能存活，尽管取骨时已用冷冻保护剂甘油处理关节面。与Mankin等报告的异体骨关节冻融后50％软骨细胞存活的结果相似, 发现非负重区的软骨是可以存活的,但不能肯定负重压力为软骨坏死的原因。 是原植骨中存活下来的软骨细胞还是修复新生的也尚不能定论。除1例大于5年者外，发现植入2～5年异体骨关节仍能保持良好外形，关节功能与形态的保持可能与异体～自体关节良好的对位、满意的稳定性及软组织覆盖有关。虽然软骨下骨、小梁骨可转变成活骨，有新骨及血管形成， 但小梁骨的吸收和新骨的力学强度不足，可能是关节面塌陷的原因。在所有的标本,除1例感染镜下可见慢性炎细胞外, 均未见明显免疫排斥反应。骨组织抗原性较弱, 经低温冷冻处理后抗原性进一步降低,并不影响临床应用效果,以为临床和实验研究证实。本组酒精贮骨只3例,故无法比较抗原性差异。