骨痂中骨形态发生蛋白和碱性成纤维细胞生长因子基因表达与骨折愈合预后
李亚非 时述山 丁华野 李 青 

摘要

为了解不同时期骨痂中骨形态发生蛋白(BMP)、 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达强度与骨折预后的关联, 本实验分别采用分子原位杂交和免疫组化的方法，观察BMP、bFGF 在兔骨折骨痂和骨缺损 骨痂中早期(2周)和晚期(12周)时的表达强度。结果显示， 在最终骨愈合的兔桡骨骨折骨痂中含有丰富的BMP和bFGF。 在骨缺损骨痂中骨断端区域BMP和bFGF表达微弱，最终骨不连。结果提示BMP与bFGF在骨修复早期的合成分泌活跃,促进骨痂形成。BMP与bFGF在骨折修复早期的表达对骨痂的形成与骨愈合有重要影响。
关键词：骨形态发生蛋白，碱性成纤维细胞生长因子，骨折，原位杂交，组化

骨折愈合与骨断端成骨细胞活性及血液循环状态与密切相关BMP有高度骨诱导活性，bFGF 也有促进成骨细胞增殖及毛细血管生成作用。本实验采用原位杂交和免疫组化的方法，观察BMP、bFGF 在兔骨折骨痂和骨缺损骨痂中早期(2周)和晚期(12周)时的表达强度 。目 的为了解骨痂中BMP、bFGF表达强度与骨折预后的关联。

1.材料与方法
1.1.主要试剂 BMP多克隆抗体(抗人BMP2A基因表达产物的兔免疫血清),第四军医大学全军分子生物学实验室提供;bFGF多克隆抗体(抗人bFGF基因表达产物的兔免疫血清)Sigma公司产品;BMP2A质粒由美国基因研究所 Dr. Wozney 惠赠 ; 地高辛试剂盒为德国 Boehringer Mannheim Biochemica公司产品;ABC试剂盒为博士德公司产品;Bouin 固定液(饱和苦味酸75ml,福尔马林25ml,冰醋酸5ml)。
1.2.动物模型及标本的制备 新西兰兔16只，体重2.0-2.5Kg。造成左侧桡骨中1/3处2mm缺损，右侧桡骨中段同法做15mm缺损，常规切除骨膜,骨蜡封闭髓腔。术后分笼饲养。于术后2、12周分别处死8只。取下双侧尺桡骨，拍X 线片， Bouin 液固定 24 小时， 置于15%EDTA溶液中脱钙，(pH7.0-7.2, 4℃)，每周换EDTA液一次，待用刀可切开骨皮质时(约6周),脱钙中止。水洗标本过夜。56℃石蜡包埋,制备5um切片，HE染色，光镜下观察。
1.3.免疫组化实验 常规切片经脱蜡至水后， 分别经甲醇—双氧水封闭内源酶，10 %正常羊血清封闭非特异性染色。按常规ABC 法进行免疫组化染色。切片经第一抗体(BMP 多克隆抗体工作浓度 1: 50,bFGF多克隆抗体工作浓度1:60)处理过夜(室温)，依次经生物素化第二抗体。ABC复合物处理30分钟，DAB显色。用磷酸盐缓冲液(PBS) 和兔非免疫血清替代一抗作为阴性对照，人毛细血管瘤和骨肉瘤组织切片作为阳性对照。
1.4.原位杂交研究 探针的标记及原位杂交研究程序按地高辛试剂盒说明书进行。标记时,每微克BMP2A　cDNA片段,分别加入2ul核苷酸六聚体混和液,2ul dNTP标记混和液及1ul Klenow酶,充分混匀,37℃反应20小时,最后乙醇收集沉淀。原位杂交时,切片经脱蜡至水后, 0 .2mol/L盐酸处理及蛋白酶消化,4%多聚甲醛固定30分钟, 系列乙醇脱水。加杂交液反应20小时(40℃),依次经2XSSC,1XSSC,0.5XSSC溶液充分洗涤,加地高辛抗体,37℃,24-48小时,最后用碱性磷酸酶显色。 对照组分别经DNA酶和RNA酶处理。

2.结 果
2.1.X线片及HE染色切片 术后两周时，X 线片显示桡骨骨折间隙少量新骨形成，而15mm骨缺损区无新骨。术后12周时，桡骨骨折断端有较多骨痂，断端连接，而15mm桡骨缺损区仍无新骨形成(图1.)。HE 染色切片显示骨折断端2周时大量新骨形成，12周时达骨愈合,有皮质及髓腔形成。15mm骨缺损2周时断端少量新骨， 缺损区为纤维结缔组织填充。 12周骨缺损区仍无新骨，断端骨有吸收。
2.2.原位杂交和免疫组化研究结果 术后两周时， 骨折骨痂的新骨骨基质、成骨细胞、骨细胞BMP免疫组化染色强阳性(图2.)， 分子原位杂交显示上述细胞核BMP染色强阳性(图3)。骨痂中成骨细胞、骨细胞bFGF免疫组化染色也为强阳性(图4.), 但未骨化的肥大软骨细胞为阴性。术后2周骨缺损区，紧邻断端的区域有BMP及bFGF染色弱阳性，缺损区纤维组织BMP分子原位杂交和免疫组化染色均为阴性。bFGF 免疫组化染色也为阴性。12周时，骨折骨痂改建， 仍有BMP与bFGF染色阳性，但强度明显减弱，骨缺损组织二者染色均为阴性。

3.讨 论
　　骨折后骨修复的确切机制仍不够完全明了。骨不连的防治也是骨科临床的一大难题。骨折修复是一个有多种因素参与的复杂生物学过 程。近年Guacci等(1) 研究发现骨不连组织中软骨细胞的结构与正常并无明显差异，但组织的血管血栓形成、栓塞。认为缺乏运输足量钙 的血供和成骨细胞活性降低是骨不连的真正原因。而那些与成骨有关 的血管的形成和成骨细胞活性的保持又有赖于成骨因子的刺激(2,3)。骨生长因子在局部刺激成骨细胞、成软骨细胞和血管增殖, 促进骨痂 初始的软骨形成和需要血供的软骨内化骨。但不同骨生长因子在骨修复的不同阶段起重要作用，并且相互调节, 单一骨生长因子即使能刺 激成骨,却不一定能促使骨折修复达到最终骨愈合。如骨折后第一,二 周骨痂中主要有TGFβ和PDGF,BMP,IGFs,bFGF不同程度的表达,此后有的骨生长因子表达增强,有的则减弱。
BMP是近年来被研究的较多的骨生长因子之一， 其骨诱导作用已为人的所熟知。BMPs在胚胎发育和骨折修复过程中有重要作用(4) 。对人骨折骨痂的分子原位杂交研究发现，骨折10天之后的骨痂中, 成骨细胞,成软骨细胞及间充质细胞均有BMP2 mRNA表达(5)。BMP有较强的骨诱导能力，临床及实验研究中已用来促进骨折修复。
近年来FGF对骨的作用也开始受到重视。FGF以两种密切相关的形式存在，即碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)。FGF储存于骨组织的细胞外基质，在组织损伤、坏死、 伤口愈合、组织改建及某些发育过程中释放出来，对骨均有明显的作用。bFGF促进成骨细胞,成软骨细胞蛋白质合成和分化增殖,协同其它骨生长因子(TGFβ、IGF、PDGF、EGF、BMP等)成骨(6)。FGF另一突出的特点是促进毛细血管生成作用，它是已知的体内作用最强的血管生长因子。FGF在体内可刺激毛细血管内皮细胞迁移和增殖， 形成毛细血管芽，同时促进纤溶酶原激活物和胶原酶分泌，对损伤部位的胞外基质部分降解，使毛细血管向创伤区长入，为损伤组织的修复提供营养(7)。实验发现bFGF具有促进血管向骨断端长入,加速植骨块新骨替代,改善断端血流率和成骨细胞活性(8)。FGF早期促进软骨形成并晚期加速新骨替代。可能是bFGF在骨移植物中造成了较多适于软骨岛形成的位 点(9)。骨痂中这两种生长因子的缺乏，可能是骨不连的原因之一。
尽管骨生长因子特别是 BMP和bFGF在骨修复方面的重要性, 但骨折骨痂中BMP和bFGF 基因表达状态与成骨活动及骨折愈合预后的关联。国内外已往的研究主要局限于骨修复某一阶段骨痂中某种骨生长因子的表达。要研究骨生长因子对骨修复的影响, 应了解不同时期骨痂中多种骨生长因子表达状态,及其与骨折愈合预后的关联,才能有效地对延迟愈合和骨不连的分子病理学进行纠正。
　　本研究以兔桡骨骨折模型模拟正常骨折愈合过程, 以兔桡骨骨缺损模型模拟骨不连。分别采用分子原位杂交和免疫组化的方法，观察BMP、bFGF在骨痂中早期(2周)和晚期(12周)时的表达强度。 结果显示，在兔桡骨骨折骨痂中含有丰富的BMP和bFGF。在骨折修复初期的2 周时，新生骨基质、成骨细胞和骨细胞，BMP与 bFGF染色均为强阳性 (图1.,2.)，在12周改建期的骨痂中，BMP与bFGF表达减弱, 最终骨愈合。提示BMP与bFGF在骨修复早期的合成分泌活跃,促进骨痂初始的软骨和膜间骨形成,并对骨痂的发展和骨化持续发挥作用。 由于在成骨细胞、骨细胞、间充质细胞中有BMPmRNA表达(图 3.),骨基质中BMP蛋白表达阳性,提示自分泌和旁分泌作用。在兔桡骨骨缺损骨痂中， 仅与骨断端紧邻的区域有微弱BMP和bFGF表达，最终骨不连。 结果提示BMP与bFGF在骨折修复早期对新骨的形成与发展有重要影响。 这种骨生长因子的低表达可能与大面积骨膜的缺损, 血管床的损伤导致的局部血运障碍、成骨活动减弱有关。而骨生长因子的低表达又不利于血运状态的改善和成骨活动的增强,形成恶性循环。
由于实验结果显示骨折愈合障碍时骨痂中BMP和bFGF 表达阴性或达程度很低,而以往的研究应用外源性BMP可促进骨缺损骨不连愈合(10),提示BMP和bFGF产生和分泌减少是骨折修复障碍的重要因素。实验结果还为应用外源性骨生长因子促进骨折与骨不连愈合提供了理论上的依据。