神经肽和人骨形态发生蛋白-2对异体骨-成骨细胞复合物成骨能力影响的观察
李亚非 马文辉 时述山 姚建华

摘要

目的：观察神经肽与人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）能否使异体骨-成骨细胞复合物在大鼠体内成骨作用增强。方法 取大鼠的松质骨作为载体，用自体成骨细胞在血管活性肠肽（VIP），神经肽Y（NPY）及rhBMP-2作用下培养6天构建这种复合物。植入大鼠臀部皮下。60Co灭活的不含成骨细胞的异体骨作为对照。于14天、28天取材，不脱钙切片，行HE、Masson's染色和BMP免疫组化染色。结果：14天实验组均有软骨和新骨形成，28天切片可见软骨内化骨，BMP染色强阳性。对照组无软骨和新骨形成，BMP染色阴性。结论：异体骨-成骨细胞复合物植入体内后其成骨细胞能存活并能通过软骨内成骨形成新骨。
关键词：神经肽，骨形态发生蛋白，异体骨，骨组织工程学

骨组织工程学研究中存在成骨细胞增殖慢和尚无理想载体两个难题。我们的研究显示血管活性肠肽（VIP），神经肽Y（NPY）及人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）可促进培养的人成骨细胞增殖，它们的复合作用均较它们单独作用的效果增强（结果另文报告）。本研究将异体骨-成骨细胞复合物与VIP、NPY、rhBMP-2共同培养，观察对成骨细胞增殖的影响。
　　
材料与方法
一、 异体骨-成骨细胞复合物的构建
1． 试剂：VIP、NPY(Sigma)分别用无血清DMEM稀释成2.2μg/ml的浓度。hBMP-2浓度为2.2μg/ml。
2． 异体骨载体的制备：取大鼠椎体和四肢长骨骨端的松质骨，经1：1氯仿甲醇脱脂，EDTA、LiCL等处理去除非胶原蛋白，再部分脱钙、水洗、切成骨粒、冻干。扫描电镜观察骨孔径100～200μm，孔率为60％。以钴60 辐照（30Kgy）灭菌并灭活骨基质中所含骨形态发生蛋白。
3． 10只雄性SD大鼠，体重260-300g。分别取每只大鼠胫骨结节下方0.5cm处骨皮质,常规方法成骨细胞培养。在第3天加0.1μg/ml VIP+0.1μg/mlNPY+0.1μg/ml BMP培养24小时，传代至有足够量初代细胞后冻存。光镜、扫描电镜观察细胞表面形态，透射电镜观察细胞器，Giemsa染色观察观察染色体并记数，Gomori钙钴法碱性磷酸酶（ALP）染色检测细胞内ALP。细胞外骨钙素（BPG）测定成骨细胞成骨性蛋白标志物的活性。培养的细胞确为成骨细胞，传代后保持正常核型未变异。
复苏冻存的成骨细胞，以异体骨为载体传代培养6天。于培养24 小时、72小时两次加0.1μg/ml VIP+0.1μg/mlNPY+0.1μg/ml BMP。成骨细胞可长入异体骨的骨孔中，呈单层贴壁生长。
二、异体骨-成骨细胞复合物的移植
1． 将成骨细胞传代培养6天的异体骨-成骨细胞复合物取出，立即植入大鼠左侧臀部的皮下组织，右侧臀部的皮下组织植入空白的异体骨作为对照。术后14天、28天各处死5只大鼠。取出臀部皮下组织中的硬结，10%福尔马林固定24小时,水洗,脱水,常规石蜡包埋,制作8μm切片,HE染色和Masson'染色,光镜下观察。
2． 部分切片ABC法行BMP (抗人BMP-2基因表达产物的兔免疫血清，第四军医大学全军分子生物学实验室提供)免疫组化研究。

结 果
新生软骨染成兰色，新生的骨髓为黄色，异体骨载体染色为棕色。
14天的标本，实验组镜下可见大量梭形细胞及肥大的间充质细胞增殖充满异体骨骨孔，有典型软骨细胞、类骨形成及软骨钙化，呈弥漫灶性分布。BMP染色强阳性，尤以新骨骨基质、成骨细胞、骨细胞为明显。对照组骨块骨孔中有梭形细胞纤维样组织增生，无软骨形成，BMP染色为阴性
28天标本，实验组的5块标本均可见新生软骨位于异体骨骨孔，大部分软骨崩解融合成蜿延迂曲的骨小梁，还可见板层骨和新生骨髓，BMP染色仍强阳性。部分异体骨吸收替代。对照组骨块骨孔中有梭形细胞纤维样组织增生，无软骨形成。

讨 论
利用骨组织工程学原理构建生物性植骨材料是目前骨科领域的研究热点之一，但迫切需要解决理想的载体材料和成骨细胞增殖速度慢两大难题。（1，2）
采用异体骨作为骨组织工程学构建骨的载体，其优点为材料来自人体，具有天然的孔度一致，分布均匀的多孔结构，含骨胶原基质成分，有利于成骨细胞良好的贴附。异体骨不同于其它尚处于实验室阶段的人工支架载体，已有数十年临床应用的历史。对于异体骨的种种特性，已有相当的了解，用于骨组织工程学载体在临床成功的可能性较大。利用异体骨-成骨细胞复合物是将多孔松质骨和成骨细胞结合在一起的生物性植骨材料。成骨细胞可长入异体骨的骨孔中，呈单层贴壁生长。研究目的在于这种生物性植骨材料植入体内后能通过软骨内化骨成骨，促进骨修复。
大量的临床与实验研究表明多肽类物质参与了骨的生长、修复与再建，如BMP、TGFβ为代表的骨生长因子，CGRP、NPY、VIP、SP、TH为代表的神经肽类物质 （3，4）。它们被认为是间充质细胞包括骨髓干细胞有丝分裂和/或骨细胞功能的局部调节因子（5，6）。我们的研究发现中枢神经损伤可引起血清和骨痂中BMP和神经肽类物质的表达发生改变，体外研究 显示NPY、VIP与 BMP复合作用后的促进成骨细胞的增殖效应最强，引起BPG及ALP活性的增高。还发现成骨细胞表面具有CGRP、VIP、NPY、NA、PTH的受体，可引起成骨细胞cAMP的动态升高。说明神经肽类可通过受体和cAMP 依赖机制对细胞产生影响（上述研究结果待发表）。因此采用神经肽类物质和骨生长因子促进成骨细胞的增殖，解决成骨细胞增殖慢的问题，在骨组织工程学研究中有较大的意义。
本异体骨-成骨细胞复合物植入皮下组织，可见软骨和新骨组织形成，对照组则无软骨组织形成。说明异体骨-成骨细胞复合物中培养的成骨细胞植入体内后可存活，增殖形成软骨并能进一步通过软骨内化骨转变为骨组织。这种成骨活动可能有三种机制（1）异体骨-成骨细胞复合物中所含的成骨细胞对植入体内后的成软骨和软骨内化骨转变为骨组织起了关键作用；（2）BMP染色强阳性提示成骨过程中的骨生长因子的自分泌作用；（3）我们先期的研究还发现神经肽类物质有引起成骨细胞胞间信息转导和胞内钙离子通道改变，有刺激成骨细胞增殖能力的潜在可能，解决成骨细胞增殖速度慢的问题。
本实验异体骨-成骨细胞复合物的制备和初步的体内实验结果满意。进一步的实验将观察异体骨-成骨细胞复合物在不同的肽类、不同的浓度下的成骨细胞增殖能力和定量地植入体内的成骨能力。

参考文献
1． Langer R et al.Tissue engineering.Science.1993;260(14):920-925。
2．Day C,Epperly M, Greenberger J; Effect of rhBMP-2 on the osteogenic
potential of bone marrow stromal cells from an osteogenesis
imperfecta mouse (oim). Bone. 1997 Jul; 21(1): 7-15
3．Lundgaard A,Aalkjaer C,Bjurholm A,et al. Vasorelaxarion in isolated bone arteries.Vasoactive intestinal peptide,substance P,cacitonin gene-related peptide and bradykinin studied in pigs.Acta Orthop Scand,1997,68:481-489.
4． Burns DM,Okuda K,Wu CH,et al. Specific high-affinity calcitonin gene-related peptide receptors stimulate the proliferation of osteoblasts and gingival cells through phosphorylation of ERK-1.Bone,1998,23(5)Supplement:S417.
5．Madsen JE,Aune AK,Falch JA,et al.Neural involvement in post-traumatic osteopenia:An experimental study in the rat.Bone, 1996,18:411-416.
6．Hukkanen M,Konttinen YT,Santavirta S,et al.Rapid proliferation of calcitonin gene-related peptide-immunoreactive nerves during healing of rat tibial fracture suggests neural involvement in bone growth and remodeling.Neuroscience, 1993,54:969-979.