胸髓横断大鼠胫骨骨痂中降钙素基因相关肽的表达及意义
李亚非 等

摘要

目的：了解胸髓横断后胫骨骨折骨痂内降钙素基因相关肽（CGRP）的表达。方法 造成大鼠胸髓横断+右胫骨骨折和单纯右胫骨骨折模型。测血清ALP，骨痂组织学检查和CGRP免疫组化染色。结果：胸髓横断+右胫骨骨折大鼠血ALP显著升高，大量纤维骨痂和软骨骨痂形成，骨痂骨化变慢,间充质细胞出现CGRP强阳性表达。结论：胸髓横断后使成骨活动增强；CGRP参与了成骨活动。骨化的变慢，可能与需要应力刺激的骨痂改建障碍有关。
关键词：脊髓损伤，胫骨，骨折，降钙素基因相关肽

中枢神经损伤伴有四肢骨折往往可以见到大量的骨痂过度生长，中枢神经损伤后异位骨化的发生率可达20%-30%[1,2] ，提示神经因素可能参与了骨代谢的调节。本研究采用大鼠胸髓横断加胫骨骨折的动物模型，研究骨痂中CGRP免疫阳性神经纤维的表达。

1．材料与方法
1.1．动物模型的制备：成年雌性Wistar大鼠64只。随机分成8组，4组做成单纯右胫骨骨折模型，4组做成胸10—11段胸髓横断+右胫骨骨折模型。手术方法：背部正中切口显露胸10—11段的脊髓，胸髓横断组切除约0.3cm脊髓。单纯骨折组不损伤脊髓，缝合背部伤口；右胫骨中段切口，锯断胫骨，穿入克氏针行髓内固定。
1．2.标本的取材制作：分别于术后3天、7天、14天、21天处死动物。患肢摄正侧位X线片,对X线片按Nordsletten[6]提出的0—3分评定。离心血清查ALP。右胫骨固定于4%多聚甲醛，10%二乙胺四乙酸钠（EDTA）溶液中脱钙。58°C石蜡包埋。5μm切片HE染色，观察骨痂形成。
1．3.免疫组化染色：8μm切片SP法行免疫组化染色。石蜡切片双氧水封闭内源性过氧化物酶，5%正常羊血清封闭，加CGRP一抗（CHEMICON INTERNATIONAL INC，工作浓度为1∶6000），4°C冰箱中24小时，加二抗37°C、30min；加三抗37°C、30min；DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。省去一抗者为阴性对照，脊髓组织切片为阳性对照。

2． 结 果
　　2．1．ALP变化：胸髓横断+胫骨骨折大鼠各时间组ALP均高于单纯胫骨骨折组，有显著差异（数值略）。
2．2．骨痂X线片观察： 21天时胸髓横断+胫骨骨折分数显著高于单纯胫骨骨折组。
　　2．3．组织学观察：3天, 7天时胸髓横断+胫骨骨折外骨膜增厚，纤维软骨骨痂量较多。单纯骨折动物纤维骨痂量少。14天时胸髓横断+胫骨骨折纤维软骨骨痂增大，但编织骨量少。单纯骨折动物纤维骨痂少，编织骨形成。21天时脊髓损伤动物仍可见大量纤维骨痂，单纯骨折大鼠的骨痂已基本转化为骨性骨痂。
2．4．免疫组化观察：
　　 2．4．1．单纯骨折组3天、7天软骨细胞周围有CGRP免疫阳性神经纤维，成骨细胞浆内CGRP阳性。14天时在编织骨的边缘有CGRP免疫阳性神经纤维，21天骨痂中的CGRP免疫阳性神经纤维减少。
　　2．4．2．胸髓横断+胫骨骨折7天时外骨膜增厚明显，软骨细胞、成骨细胞胞浆内CGRP强阳性，髓腔内有大量基质细胞CGRP阳性。14天时骨膜及髓腔内CGRP阳性细胞强度减弱，少量编织骨，周围有少许成骨细胞CGRP弱阳性，偶可见少量CGRP免疫阳性神经纤维。21天组上述细胞内CGRP阳性只存在于少量成骨细胞。

3.讨 论
　　本研究造成大鼠胸髓横断+胫骨骨折模型，主要观察骨痂中CGRP肽能神经纤维和CGRP阳性细胞的分布、血清ALP的变化、骨痂量的改变。
本世纪30年代以来，发现骨组织中有来自骨膜的神经末梢，分布于小血管或骨细胞周围。起初认为这种神经分布与痛觉的传递和骨的血流调节有关。后来的研究发现SP、CGRP可刺激成骨细胞集落形成抑制破骨细胞的骨吸收作用。在鼠长骨骨化中心、骨膜、骨髓及骨痂中，有多种肽能神经如CGRP、P物质、小肠血管活性肽、神经肽Y免疫组化阳性末梢分布。切断大鼠坐骨神经，可使胫骨骨折后骨痂量增加，骨痂内肽能神经减少，生物力学强度差。同时骨不连组织中缺乏肽能神经纤维的分布。这些纤维有密集的膨体，大多数走行于骨细胞之间，但与骨细胞是否有突触的接触和神经递质的传递，是否会对骨细胞的代谢产生影响，尚不清楚。
3．1．关于动物模型
以往对失神经状态下骨折愈合的研究主要是周围神经切断后对骨折愈合的影响[4、5] ，但伴随着血管走行的交感神经仍可长入骨痂，切断周围神经并不能造成胫骨完全失神经支配，骨痂中仍有神经长入。但这两种动物模型不是可靠的完全丧失神经支配的模型[4、5]。
本实验采用T10—11段胸髓横断可使T10平面以下感觉、运动神经功能丧失，同时也可使支配下肢的腰交感链丧失绝大部分功能，胫骨缺神经程度更高。但在损伤平面以下，神经仍有低级反射中枢存在，脊髓的背根神经节存在，虽然脊髓损伤后背根神经节内的神经元细胞会减少萎缩，但仍会有少许成活，它们仍可能产生神经介质，这需要进一步检测损伤平面以下背根神经节内神经介质的变化。
3．2．胸髓横断后骨痂CGRP的改变及其意义
CGRP纤维主要分布在干骺端、骨膜、骨髓成骨活动活跃的区域，骨痂中也发现有CGRP神经纤维分布[5]，一般认为血液循环中的CGRP含量很低，CGRP可能主要通过神经纤维轴浆转运到局部起作用。
　　骨痂中CGRP纤维的分布量比单纯骨折大鼠骨痂中CGRP纤维量要少，与文献报道相一致[5]。但胸髓横断+胫骨骨折的大鼠3天、7天时成骨细胞、间充质细胞、骨髓基质细胞浆内即出现CGRP强阳性，血清ALP活性较单纯骨折动物高。细胞浆内CGRP阳性物是从血中摄取的还是这些细胞在失神经后自身合成的，尚需进一步行血中神经肽的检测和原位杂交实验。
　　3．3．CGRP对骨痂量和成熟的影响 神经纤维的长入与骨的矿化过程相平行[8]。Madsen等[5]采用大鼠坐骨神经加股神经切断，造成胫骨骨痂量增多，但骨痂中肽能神经纤维减少，骨痂生物力学强度降低，提示骨痂形成和成熟过程中神经长入的非常重要作用。本实验显示胸髓横断+胫骨骨折大鼠骨痂量大于单纯骨折骨痂量，骨痂中CGRP免疫阳性神经纤维和编织骨量少，提示骨痂的成熟障碍。骨髓基质细胞、间充质细胞、幼稚的软骨细胞浆内出现CGRP阳性表达，CGRP能促使这些细胞的增殖、分化[7]，使得大量的软骨细胞团形成，骨痂量较多，但骨痂停滞在纤维骨痂与软骨骨痂期。这可能是失神经后骨痂增殖但骨痂力学强度差的原因。
　　结果提示：①胸髓横断+胫骨骨折大鼠骨膜间充质细胞、成骨细胞和骨髓基质细胞浆内CGRP阳性，骨痂大量增殖，ALP增高，提示CGRP在局部参与着骨代谢。但尚需进行脊髓损伤后血清相关神经肽水平测定，和成骨细胞CGRP原位杂交研究②骨痂骨化过程的变慢，可能与局部失神经后缺乏负重等力学刺激，使需要应力刺激的骨痂改建障碍有关。


参考文献
1.MCMaster WC，Stauffer ES.The management of long bone fracture in the spinal Cord injured patient. Clin orthop,1975,112:44-52.
2.Spencer R.the effects of head injury on fracture healing: a quantitative assessment. J Bone Joint Surg,1987,69B:525-528.
3.Konttinen YT,Imai S,Suda A. Neuropeptides and the puzzle of bone remodeling. Acta orthop Scand,1996,67:632-639.
4.Hukkanen M,Konttinen YT,Santavirta S,etal. Effect of Sciatic nerve Section on neural ingrowth into the rat tibial fracture callus. Clin orthop,1995,311:247-257.
5.Madsen JE,Hukkanen M,Aune AK,et al. Fracture healing and callus innervation after peripheral nerve resection in rats. Clin orthop,1998,351:230-240.
6.Nordsletten L, Madsen JE, Almaas R, et al. The neuronal regulation of fracture healing: effects of sciatic nerve resection in rat tibia. Acta Orthop Scand, 1994,65:299-304.
7.Imai S,Rauvala H,Konttinen YT,et al.Efferent targets of osseous CGRP-immunoreactive nerve fiber before and after bone destruction in adjuvant arthritic rat:an ultramorphological study on their terminal-target relations. J Bone Miner Res,1997,12:1018-1027. 
8.Frenkel SR, Guerra LA, Mitchell OG, et al. Nerve growth factor in skeletal tissues of embryonic chick. Cell Tissue Res,1990,260:507-11.
本文为1998年国家自然基金课题39770745《肽能神经因素影响骨修复机理的研究》分题