肽能神经调节骨修复的研究进展
北京军区总医院骨科 姚建华综述 李亚非审校

骨折愈合过程复杂,参与因素极多，骨修复一旦启动，则由多种生长因子、细胞因子、激素和物理刺激（包括生物电、重力、机械力）及营养等各种因素共同调节，其确切机理尚不完全清楚；而神经因素是否参与了骨折愈合的调节更是悬而未决的问题。在临床实践中，人们观察到一些有趣的现象，截瘫和颅脑损伤患者伴随的四肢骨折往往可以见到大量的骨痂过度生长[1，2],甚至在肌肉中出现异位骨化[３],骨折愈合明显快于没有中枢神经损伤的四肢骨折者;而神经性关节炎患者,由于感觉神经损害,患肢骨折愈合往往明显延缓,骨不愈合率较高[４]。这些现象提示神经因素对骨折愈合有影响。近年来，随着对神经肽研究的不断深入和免疫组织化学技术的进步，含有Ｐ物质（substance P,SP)、降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide,CGRP)、小肠血管活性肽（vasoactive intestinal peptide,VIP)、神经肽Ｙ（neuropeptide Y.NPY)和酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH)等５种神经肽的肽能神经在骨组织中已被发现[5.6]，这些肽能神经在骨组织的分布、数量与骨组织的生长、修复、改建密切相关，引起了人们的广泛关注。

一、正常骨组织的肽能神经支配
人们对正常骨组织神经支配的认识过程经历了漫长而曲折的过程。早在１５０年前，就有人通过解剖发现骨组织中存在神经纤维，进一步研究发现许多无髓和有髓的神经纤维支配骨膜、骨组织和骨髓[７-９]。由于这些神经纤维大多分布在骨代谢活跃区，推测这些神经纤维与骨的塑型和生长有关。过去研究者采用银染法来显示骨组织的神经纤维，很难精确区分不同种类的神经纤维，这阻碍了人们认识神经因素影响骨代谢的进程。近年来，随着组织处理方法的进步，尤其是脱钙技术的改进[10],使人们能应用免疫组织化学技术来研究正常骨和病变骨中感觉和自主神经纤维的分布规律及其中神经肽的含量，从而可以区分不同来源的神经纤维,进一步明确不同神经纤维的作用。这是该领域研究史上的一次重大突破。
骨组织的神经支配过去推测主要来源于自主神经，而现在可用不同神经肽免疫组化染色来显示不同的肽能神经，其中含ＳＰ、ＣＧＲＰ的肽能神经来源于感觉神经，含ＶＩＰ、ＮＰＹ的肽能神经来源于自主神经，含ＴＨ的肽能神经来源于儿茶酚胺类神经[５]。这些神经共同存在于骨组织中，主要分布于骨代谢活跃的区域，如骨膜、骨骺、骨髓。其中ＣＧＲＰ免疫阳性神经纤维由于分布广泛更受到重视。支配骨膜的肽能神经呈网络状分布于骨的表面，且骨骺的分布远较骨干多，含ＣＧＲＰ和ＶＩＰ的神经分布于骨膜各层，骨髓腔也受ＳＰ和ＣＧＲＰ免疫阳性神经纤维[11，12]。ＶＩＰ纤维绝大部分分布于骨膜，在骨内，主要分布于骨髓与骨骺，并且它的分布与血管无关。而ＮＰＹ和ＴＨ神经分布明显与血管相关，主要存在于接近生长板的骨骺区和骨髓中，ＮＰＹ和ＴＨ在大多数神经中共存[５]。值得注意的是骨骺生长板骨软骨接头的肽能神经支配，其骨骺一侧受丰富的肽能神经支配，而干骺端一侧几乎没有肽能神经[11,13]。骨组织中不同部位肽能神经分布的多少，还可通过检测这些部位神经肽量的多少反应出来。Ahmed等⒁用放射免疫的方法提取并分析了不同部位神经肽的量，发现皮质骨神经肽量最低，ＮＰＹ在骨膜、骨髓内均较多，ＶＩＰ、ＣＧＲＰ在骨膜的量较髓腔内多。超微结构观察发现ＣＧＲＰ免疫阳性神经纤维与破骨细胞形成高电子密度影，认为这种神经作用于破骨细胞影响骨代谢[13]。进一步研究ＣＧＲＰ免疫阳性神经纤维作用的靶细胞，认为干骺端的成骨细胞和破骨细胞，骨膜的衬里细胞（periosteal lining cells)是骨组织ＣＧＲＰ免疫阳性神经纤维作用的靶细胞⒂]。

二、正常骨折修复过程中肽能神经变化
骨折修复过程就是骨痂形成和成熟的过程，这个过程与胚胎骨形成过程相似，神经纤维被诱导长入这些组织。Sisask〔16.17〕通过研究鼠胚胎骨形成过程中的神经支配，认为鼠出生时其骨组织即受感觉神经和自主神经支配，且神经长入与骨的矿化过程相平行。因此在正常骨折修复过程中神经长入非常重要，其在骨痂中的分布和数量引起了人们的兴趣。Bjurholm⑸在诱导成骨的实验中发现２周时ＳＰ，ＣＧＲＰ，ＮＰＹ和ＴＨ免疫阳性神经纤维存在于纤维组织分化成的软骨母细胞之间，５周时诱导生成的骨痂中神经支配增加，神经形态及分布与正常相似，８周时ＣＧＲＰ阳性纤维仍有增加，提示ＣＧＲＰ参与骨痂 的成熟与改建。Ｈukkanen等⒅发现骨折能强力诱导神经再生长入骨折部位，骨折后７天，骨痂内即可检测到蛋白基因产物(Protein gene product 9.5,PGP9.5)和ＣＧＲＰ免疫阳性的感觉神经纤维，图像分析显示７天后神经纤维增加，骨折后２１天ＣＧＲＰ免疫阳性的骨膜神经纤维较正常对照组增加３倍以上，提示这些增生的感觉神经纤维能产生可以影响骨折愈合浓度的神经肽，从而参与正常骨折愈合过程。为排除负重引起的骨痂形成差异，他们进一步研究了制动后骨痂中神经纤维的分布和神经肽的含量，发现骨折后２５天骨膜、骨痂和骨髓腔内均可见神经纤维，其中许多神经纤维ＣＧＲＰ免疫反应阳性且表达生长相关蛋白（growth associated protein,GAP-43/B-50)提示神经纤维正在再生长入⒆。在移植骨修复过程中，移植骨必须再神经化才能完成骨爬行替代愈合过程⒇说明神经长入影响骨愈合过程。由于这些神经纤维在骨痂中主要分布于纤维骨痂向软骨骨痂分化的成软骨细胞间及软骨骨痂向骨性骨痂转化的骨基质边缘成骨细胞附近，提示这些肽能神经可能与骨痂的成熟有关。

三、神经损伤对骨折修复的影响
神经因素影响骨修复的研究目前主要集中在周围神经损伤后对骨折愈合的影响，并建立了许多动物模型。有人采用坐骨神经切断＋胫骨骨折或腓骨骨折模型[21.22.23],有人采用大鼠坐骨神经、股神经切断＋胫骨骨折模型[24],也有人采用切断支配下颌骨的交感神经来研究对下颌骨代谢的影响[25],而中枢神经系统损伤合并骨折修复的研究较少见。那么神经损伤对骨折愈合到底有什么影响呢?由于实验方法的差异,观察指标不一,不同的研究者得出了不同甚至截然相反的结论。
（一）周围神经损伤对骨折修复的影响
早期实验表明，从Ｘ线片上看，坐骨神经损伤对犬腓骨截骨愈合无明显影响[21]。后来Frymoyer等[22]通过Ｘ线检查发现失去坐骨神经支配的大鼠胫骨骨折愈合延缓，但是Ｘ线片评价骨折愈合不精确，需要进行组织学，生物力学，骨矿化快慢等指标来评定。
Ａro等[21]研究了合并坐骨神经切断的大鼠胫骨骨折，观察到骨折愈合早期，坐骨神经切断组骨痂的张力显著高于对照组，愈合晚期，Ｘ线片显示骨痂量多，但透光不规则。Ａro等[23]还发现伴坐骨神经切断的大鼠胫骨骨折愈合加快、但生成的骨痂较小，且不够致密，胶原基质和矿物质含量少。由于负重可影响骨痂的形成量，有人完善了实验设计[26]，采用骨折肢体管型石膏固定，以消除负重因素的影响，并得出如下结论：坐骨神经损伤后胫骨骨折骨痂量增多，但骨痂生物力学强度较对照组差；骨痂的骨矿化指标锶８５结合率与对照组相同，说明神经损伤对骨痂矿化无影响。Ｍadsen等[24]采用坐骨神经、股神经切断＋胫骨骨折模型，得出结论与前一实验一致。而Ｍadsen等 [27]在另一实验中发现神经损伤侧骨组织骨矿化率较对照组低１０％。从近几年的实验来看[24，26]，周围神经损伤后骨痂增多，但生物力学强度低的结论已基本一致，而骨痂骨矿化是降低了还是与正常一样，尚不统一。
有学者应用神经毒素Capsaicin阻断交感神经或用切断交感神经的方法，观察失交感神经后骨代谢的改变，发现失去交感神经支配后，局部骨组织丢失，骨吸收作用增强[25，28]，提示交感神经在骨修复过程中具有重要作用。
周围神经损伤后骨痂中是否有肽能神经长入呢？同正常骨折一样，伴有神经损伤的骨折局部仍有吸引神经长入的能力。由于骨组织的神经支配来源于感觉和交感神经系统，周围神经干损伤并不能完全使骨组织失神经⒆，因此骨痂中仍有肽能神经纤维长入，但神经纤维明显减少[24]，改变了骨痂神经分布方式，从而也改变了骨折的愈合方式。虽然坐骨神经切断影响骨痂的质和量，骨痂形成加快且量多，但骨痂密度不规则，强度也没有增加，提示骨痂的组织结构有缺陷。由于上述动物模型均不能使骨组织完全失神经支配，对骨组织完全失神经支配骨代谢、修复的研究尚需建立新的动物模型。而中枢神经系统损伤对感觉、运动、交感神经均有影响，因而建立中枢神经系统损伤伴骨折动物模型研究骨修复方式非常有意义。
（二）中枢神经损伤对骨折愈合的影响
临床观察中枢神经系统损伤合并骨折患者骨折愈合加快，骨痂量多，但在动物实验中，可能是因为中枢神经系统损伤的动物模型难建立，这方面的研究相对较少，研究也不深入，只观察了骨痂量和强度的改变，而无骨痂中肽能神经和血清中神经肽检测的报告。Ｘ线片显示，合并脑外伤的豚鼠尺骨骨折愈合加快〔22〕未成熟大鼠Ｌ３－Ｓ１主要神经支全部切断后，骨痂生成增加〔28〕。而家兔中枢神经系统皮层损伤后，骨痂生成减少〔22〕。
脊髓损伤和坐骨神经损伤对骨折愈合的影响相似，但并不完全一样。两者皆能增加骨折愈合早期骨痂的形成，通过桥梁骨痂促进骨愈合，生成的骨痂都较疏松，生物力学强度差，但脊髓损伤增加了骨痂大小的变异，且能增加软骨内骨化前骨痂中非胶原氮的浓度〔23〕，使得骨痂成熟减慢。

四、作用机理
肽能神经调节骨修复的机理目前比较肯定的是神经肽直接对靶细胞的作用和血管扩张、血管生成作用。而其它机一只是一些推测。
（一）神经肽对骨细胞的直接作用：神经系统对骨折修复的影响可能由感觉神经纤维和自主神经节后纤维释放的神经肽介导⑾。这些神经肽可直接调节骨细胞，与成骨细胞、破骨细胞膜上的神经肽受体结合。Ｂurns等〔29〕证实ＣＧＲＰ能与成骨细胞膜上受体结合，每个成骨细胞有３０００－３５００个受体结合位点，并能刺激成骨细胞促进成骨；ＣＧＲＰ还可通过与破骨细胞上的降钙素受体结合，有抑制骨吸收的作用〔30〕。它还能通过刺激干细胞有丝分裂和骨先质细胞分化刺激骨形成〔31〕。ＧＯＴＯ等〔32〕发现破骨细胞膜上存在ＳＰ高亲和力受体神经激肽１受体（ＮＫ１－Ｒ），ＳＰ与之结合后能促进破骨细胞增殖，参与骨吸收；Ｓhih[33] 用ＳＰ培养骨髓干细胞，能促使成骨细胞增殖。而ＶＩＰ则通过cＡＭＰ依赖机制刺激骨吸收[34]。
（二）神经肽影响骨折局部血供：有血液供应是骨折愈合的先决条件，一切影响血液供应的因素，都会直接影响骨折愈合。血流在很大程度上受神经机制控制，在骨组织的血管周围有大量的ＣＧＲＰ、ＮＰＹ、ＳＰ免疫阳性神经纤维〔5,18,19〕,而ＣＧＲＰ、ＳＰ、ＶＩＰ是较强的内源性扩血管肽，神经系统可通过这些递质调节血管功能，增加骨折 局部血供[35,36]。同时ＣＧＲＰ、ＳＰ在血管内皮细胞上有受体，与内皮细胞结合可促使内皮细胞增殖，有刺激血管生成作用[37,38]，为骨折修复改建创造了条件。ＮＰＹ是调节骨组织中血管张力的交感神经递质，有血管收缩作用[39]。因此神经切断减少了神经因素对血管功能的控制，导致骨折部位缺氧，从而刺激骨痂组织内软骨细胞的大量增殖，骨痂增多⒆，
（三）神经肽与细胞因子：目前发现许多细胞因子通过自分泌和旁分泌这两种基本方式调节骨和软骨的生成[39]，这些细胞因子包括骨形态发生蛋白（ＢＭＰＳ），转化生长因子－β（ＴＧＦ－β），胰岛素样生长因子（ＩＧＦ－Ｉ），成纤维细胞生长因子（ＦＧＦＳ），血小板衍生生长因子（ＰＤＧＦ），肿瘤坏 死因子（ＴＮＦ）和来源于造血细胞系细胞的一些因子如白介素－１，３，６（ＩＬ－１，３，６），粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）和粒细胞－白细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）等。在神经肽的研究中，Ｖignery等[40]发现用ＣＧＲＰ培养鼠股骨原始成骨细胞，可使其产生ＩＧＦ－Ｉ，促进成骨。ＳＰ可调节干细胞因子和ＩＬ－１的生成[41]；Ｈukkanen等⒅发现ＣＧＲＰ免疫阳性神经纤维周围有炎症细胞存在。正常时ＣＧＲＰ对炎症细胞有抑制作用[42]，当神经损伤时，ＣＧＲＰ减少，对炎症细胞的抑制作用降低，可使骨折局部炎症反应加强，产生许多细胞因子如ＴＮＦ，ＩＬ－１，Ｇ－ＣＳＦ等，这些因子在骨折早期可促进成骨[43]，骨痂量增多。
（四）神经肽与神经生长因子（ＮＧＦ）：Ｆrenkel[44]发现鸡胚的软骨和骨细胞６－１４天期间ＮＧＦ表达阳性，他认为骨折愈合过程与鸡胚胎骨形成过程相似，骨痂内和其它未成熟骨组织的细胞可能产生ＮＧＦ，以诱导神经纤维长入骨痂中。神经长入可使神经肽递质在骨折局部释放，促进成骨，且Malcangio[45]发现NGF能刺激大鼠脊髓ＳＰ、ＣＧＲＰ的释放，可刺激成骨。当神经损伤伴骨折时，失神经的骨折部会产生大量的ＮＧＦ，一方面ＮＧＦ可使ＳＰ、ＣＧＲＰ释放增加，另一方面ＮＧＦ也可与成骨细胞上的受体结合，促使骨细胞磷酸化，成骨能力增强[46,47]，导致神经损伤伴骨折骨痂量多。神经肽与ＮＧＦ一样，同样有神经营养作用，而且神经肽在神经元之外也有细胞分泌 [48]即神经肽的“双重分布”，说明神经元只不过是分泌细胞的一种形式而已。在神经损伤后是否骨细胞也能产生神经肽？有待深入研究。同时由于神经损伤后，骨痂中神经纤维长入障碍，ＩＧＦ－Ｉ只能刺激软骨细胞产生Ⅱ型胶原，使软骨内化骨过程减慢[49]。
（五）神经体液调节：脊髓损伤和颅脑损伤患者的血清可促进成骨细胞活性[50]，而脑损伤患者骨折愈合加快，可能是通过体液机制调节[51]。
（六）神经肽与痛觉感受器：骨膜骨髓存在痛觉感受器，感觉疼痛刺激通过ＳＰ向中枢传递，因此骨痂中的ＳＰ神经纤维可起保护性作用，保持骨折端的相对稳定，有利于骨愈合[52]。当神经损伤后，由于痛觉刺激消失，运动纤维也阻断，致肌肉瘫痪，使骨折端活动度增加，刺激骨痂增生。

五、展望
肽能神经调节骨折修复的研究只有１０余年的历史，有关这方面的研究尚少，对其作用机理，我们仍知之甚少。近年来，随着神经肽研究的飞速发展，肽能神经调节骨生长、修复、改建的研究逐渐成为热点。虽然当前一些经典临床论著尚未提及肽能神经是影响骨折修复的因素之一，但随着在该领域的研究不断深入，相信不久的将来，肽能神经影响骨修复的理论会不断完善，并在影响骨折修复诸因素中占有一席之地，进一步认识和完善骨折修复理论。为此，今后研究应着眼于以下几个方面。⑴建立骨折完全失神经支配的模型，以了解在完全没有周围神经支配条件下骨折愈合的快慢、方式、骨痂质量的变化和神经肽变化。建立中枢神经系统损伤伴骨折的动物模型，深入研究中枢神经损伤对骨折愈合的影响。⑵神经肽影响骨折愈合的作用机理如何？骨组织是否产生神经肽？神经肽与神经生长因子，其它细胞因子之间的相互作用有何联系，能否建立神经－免疫－内分泌为轴心的影响骨折修复理论？这些问题有待深入研究。⑶临床研究应侧重于骨不连、异位骨化和骨质疏松的研究。有人发现在人长骨不连组织中几乎没有神经支配，提示缺乏神经控制可能导致延迟愈合或骨不连[53]。异位骨化组织中有肽能神经长入[5]，而ＣＧＲＰ可明显抑制破骨细胞功能，可用于防治骨质疏松[27]。是否通过应用神经肽治疗骨不连和其它骨病，利用神经肽拮抗剂阻止异位骨化，将是今后研究的重点和方向。⑷目前骨组织中存在的神经肽氨基酸序列已确定，随着多肽合成技术的改进，批量生产完全可能。一旦神经肽影响骨代谢理论确立，神经肽应用于骨科临床指日可待。

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