骨组织工程学种子细胞实验应用现状
常红星 综述 李亚非 审校

在过去的几十年里，骨修复一直是困扰着矫形外科医生的一个难题，每年都有大量的病人需要手术修复由急性创伤、先天性畸形、良性和恶性肿瘤、骨感染及骨折不愈合所导致的大块骨缺损，却因缺乏足量合适的植骨材料始终难以得到令人满意的治疗。
　　长期以来，新鲜自体骨移植因含有骨祖细胞（osteoprogenitor cells）、具有骨诱导能力及可提供自体细胞生长支架仍然是修复骨缺损、重建功能的一种标准手术方法，但因供骨数量有限，形状也难以满足临床需要，且增加手术创伤，使其临床应用受到很大限制。寻求合适的骨替代材料用于骨缺损的生物性重建是其出路所在。近几十年来，着力于寻求合适骨替代材料的研究十分活跃：同种骨，如脱钙骨基质；异种骨，如脱蛋白骨粉；无机材料类，如磷酸钙生物陶瓷，羟基磷灰石；有机合成可降解聚合物，如聚乳酸，聚乙醇酸，以及各种复合材料，如胶原羟基磷灰石，骨形成蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）复合人工骨等,取得一定进展。但作为一种异物，各材料都有自身的弱点，如同种异体骨、异种骨有可能传递感染病原、宿主的免疫排斥反应以及各材料因无生物活性其愈合均以爬行替代方式进行[1，2]而导致愈合过程缓慢等，还是不能令人满意. 
　　近二十年来，随着组织培养、生物材料技术的发展，对成骨细胞的来源、培养条件及生物材料进行了大量的研究。1977年Green进行了将活细胞种植到人工材料上并将此复合物植入动物体内的试验。组织工程学再造组织的出现为骨修复提供了新的方法。在此基础上Ohgushi[3]及Breitbart[4]等开始应用含有活细胞的异体植入物来修复实验性骨缺损，取得了成功的经验。1995年Vacanti等[5]正式将组织工程学定义为应用工程学和生命科学原理的研究组织生物替代物一个边缘科学，它将经体外分离、培养的高浓度的功能相关的活细胞种植于天然的或人工合成的支架上，使之植入人体后能够形成新的有功能的组织，来制造、保存或恢复失去的组织功能。组织工程是组织培养、材料科学和移植领域发展的结果。骨的组织工程学，与其他组织类似，需要三个基本要素：1）能够形成新生组织的细胞成分。细胞可从外源性细胞或局部组织细胞中诱导分化而形成。2）诱导细胞适当生长的生长和分化因子。这些因子可以是局部或外源性经提纯的蛋白或植入细胞的分泌产物。3）有利于细胞附着、增殖和分化的基质支架。其全过程包括种子细胞的选择和培养、种子细胞和生物材料复合后联合培养、复合体植入体内三个步骤。目前研究较多的是种子细胞的培养和新型生物相容性好的可降解材料的制造。其中，种子细胞的获取和体外培养、扩增无疑是基础和最为重要的环节。

　　1. 成骨性种子细胞的来源 
　　骨形成是由一系列复杂的过程所组成，在此过程中首先是骨祖细胞的补充和增殖，然后是细胞的分化、类骨质形成及最终的钙化。骨巨大的再生能力提示有能够自我复制并能多向分化的干细胞存在。一般认为，此类干细胞存在于骨、骨膜、骨髓及其他由中胚层发育来的组织中，在出生后仍然有少量细胞继续存在，在机体损伤时参与组织的修复。组织工程的基础是有功能的细胞，成功的骨组织工程需要大量的成骨细胞。十多年来，国内外学者和临床工作者对各种组织的细胞成骨能力进行了大量的研究。提出了定向性骨祖细胞、诱导性骨祖细胞和基质干细胞的概念。给体外分离、培养、扩增出大量的有成骨活性的细胞以满足再造骨组织的需要提供了美好的前景。目前，在研究中使用的作为种子细胞的成骨细胞来源有以下几种：骨、软骨、骨外膜、骨髓和骨外组织。从临床应用来看，理想的骨组织工程种子细胞应具备下列特点：（1）取材容易，对机体的损伤小。（2）在体外培养过程中具有较强的传代繁殖能力在较短时间内能够得到较大数量并易定向分化为成骨细胞。（3）植入机体后能适应受区的环境并保持成骨活性。 

　　1.1 骨组织：Mill等1979年第一次描述了人类的骨细胞的分离方法，此后许多组织报告了用特定的成骨细胞表型分离人骨细胞的方法。Beresford等[6]的实验证明骨源性细胞表达的某些细胞标记与皮肤源性成纤维细胞相比有很大的不同，骨源性细胞能产生骨钙素,有较高水平的碱性磷酸酶活性并对向钙激素有反应。Robey[7]则采用胶原酶处理松质骨块以除去结缔组织和骨髓造血成分, 再将经处理的骨块培养来获得更纯净的成骨细胞群。Jonsson等[8]在实验中用生化标记比较了不同的细胞分离方法所得到的成骨细胞表型，发现成骨细胞从胶原酶处理过的松质骨中长出需要更长的时间，达到汇合的速度也慢于同源的骨髓基质细胞，并具有低水平表达的碱性磷酸酶活性，但具有高水平的I类胶原合成并在维生素D诱导下出现较多的骨钙素分泌。Malekzadeh等[9]采用EDTA和胶原酶消化胎儿颅骨以获得具有高度碱性磷酸酶活性的成骨细胞,并证明其在人工材料上能够继续增殖达20倍以上。Malaval 等[10]在胎鼠颅骨细胞增殖动力学研究中发现其在分化过程中表达成骨细胞标志并最终形成骨性结节，证明骨祖细胞的存在。但因骨组织取材和培养均有一定的难度，目前对其研究应用已逐渐减少。

　　1.2 骨膜：骨膜早已被证明含有能够形成骨和软骨的骨系祖细胞群，在适当的条件下形成骨和软骨。实验和临床经验都证明，骨膜的完整性对骨的再生起着至关重要的作用。单纯的骨膜及体外培养的骨膜都能保持其成骨能力，移植于骨缺损处可促进骨的再生。Uchida等[11]在大白鼠股骨损伤实验中观察到临近损伤部位的骨膜和骨内膜在术后3天显著增厚并有丰富的骨祖细胞出现，该细胞位于骨膜和骨内膜的内层，呈碱性磷酸酶阳性，并能够与增殖细胞核抗体反应，从第五天开始向成骨细胞分化并加入骨膜和骨髓的骨形成过程，在此过程中细胞骨钙素mRNA表达阳性。Breitbart等[4]体外培养新西兰大白兔的骨膜，发现骨膜细胞在4天内从组织块长出，在单层细胞培养中细胞为成纤维细胞样，呈纺锤形结构；骨膜细胞在培养中表达了骨钙素、I类胶原等成骨细胞标记，骨钙素在有无地塞米松存在的条件下均有表达，但在地塞米松存在时第14天有显著的增加。当其放入三维支架后，细胞外形变为星形，将其植入体内成功的修复了兔颅盖骨缺损。因骨膜相对较易获得和培养，近几年广泛的应用于骨组织工程学的各项研究中。

　　1.3 骨髓：骨髓是由造血系统和基质系统组成的复合组织，基质系统又是包括脂肪细胞、网状细胞、内皮细胞和成纤维细胞等不同成分的混合物。多年来，骨髓在临床上广泛用于促进骨折的愈合。近来一系列的实验结果证实了骨髓基质中能够分化为骨、软骨、脂肪组织的多能干细胞的存在及其在合适的条件下可以生成骨、软骨、肌肉和脂肪及韧带[12，13]。这种祖细胞能够不断自我复制而不分化,被称为基质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）[14]。目前骨髓中MSCs的分离方法一般以密度梯度离心和细胞培养技术为基础，从非贴附生长的细胞中分离出能贴附于玻璃和塑料上生长的基质干细胞[16，17]。Maniatopoulos等[15]认为MSCs中又可分为确定性骨祖细胞(DOPC)和诱导性骨祖细胞(IOPC)，因此其为干细胞及处于不同分化阶段的前体细胞的混合物。因此在单纯培养中只有少量细胞具有碱性磷酸酶（ALP）活性并形成钙结节，而在有地塞米松等生物因素存在的条件下，才能促使其大量向骨系细胞方向转化。他们第一次观察到MSCs在体外培养条件下形成骨样钙化结节，并利用形态学标准及碱性磷酸酶活性、I类胶原、骨钙素检测确定其终末分化细胞为成骨细胞，现在这些标志物已成为鉴定成骨细胞的公认标准。为表明利用MSCs的组织再生治疗在临床的可用性，进行了一系列的实验研究。采集大白鼠、犬和人的MSCs在体外培养扩增后种植于羟基磷灰石/磷酸三钙载体，分别将其植入同基因的鼠、犬和去胸腺大白鼠体内，成功地修复了标准的股骨干骨缺损[18]。虽然骨髓中MSCs的数量较少，仅为200个/ml但经体外培养MSCs的数量能够增加数亿倍而不失去其成骨能力。经过短期（2-3代）的培养就可以得到足量的骨祖细胞（30-50×106）来进行成人大块骨缺损的修复。[19]并且因为骨髓采集较容易，对患者损伤小，目前已成为骨组织工程主要的种子细胞来源。

　　1.4 骨外组织：骨折部位及体外培养的成纤维细胞的成骨作用已在体内外实验中得到证实。成纤维细胞与骨系细胞一样起源于间充质细胞，在骨发生、骨修复过程中，成骨细胞、成软骨细胞和成纤维细胞可表达成骨的共有表型[20]。因此，存在于骨髓、骨外膜、牙周韧带的间充质细胞的成骨作用一直为人们所重视。邓廉夫等[21]体外培养的人体真皮成纤维细胞在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和BMP2的联合诱导下由长梭形向圆形演变,骨钙素及ALP分泌水平明显升高,在其表面形成新生骨组织结节.可以认为成纤维细胞或成纤维样细胞参与成骨现象是成纤维细胞固有特征在特殊环境、特殊需要条件下所进行分化的不同表现。一定浓度的TNF-α和BMP-2联合应用，是诱导成纤维细胞成骨表型表达的因素之一。实验证明部分脂肪细胞能够去分化到可增殖状态并向成骨方向分化。Park等[22]将从骨髓中分离出脂肪细胞，经培养形成具有典型脂肪细胞表现的单克隆脂肪细胞，将其置入成骨性培养基质(含地塞米松、抗坏血酸、1,25二羟维生素D3)中则呈现出成纤维细胞样表现，ALP、骨钙素检测阳性，并有钙化斑形成。实验还证明群落中的脂肪细胞可分为终末分化细胞和非终末分化细胞两类，非终末分化细胞具有再次增殖、分化的能力，在适当条件下可向其他方向分化，从一方面证实了确定性细胞和诱导性细胞的存在。如果其中机制能够明白，对组织再造应有极大的推动作用。

　　2.骨祖细胞的确认
　　骨祖细胞(Osteoblast progenitor cells)或成骨干细胞(Osteogenic stem cell)的命名的标准是其自我维持和自我更新能力，即干细胞通过它不对称性的有丝分裂，在不断产生祖细胞的同时，使自己不增殖也不分化。所以，正常干细胞的特征便是在体内外保持自己数量不变，质量也不变的条件下不断地生成大量祖细胞。目前没有单一的明确的细胞表面标记来确认骨祖细胞。一般方法仍是利用密度梯度离心分离出骨髓中的低密度单核细胞，根据其贴附生长能力来分离。该细胞称为基质干细胞（MSCs），在体外培养时可以大量的增殖，细胞数能够增加达数亿倍[19]，在诱导性成骨培养液—含有地塞米松、抗坏血酸、甘油磷酸盐—中能够向成骨细胞分化。在其分化过程中，先后出现特征性的骨细胞标志：合成I类胶原，表达碱性磷酸酶，分泌骨钙素及有羟基磷灰石沉着[23，24]。STRO-1是由用CD34+的骨髓细胞免疫的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体，它能够与骨髓基质细胞结合，但STRO-1与CD34抗原并不完全一致，骨髓细胞中STRO-1+/CD34+细胞比例极低，研究发现，STRO-1和CD34类似，均在未成熟细胞上有高水平的表达，但当长期培养大量其他分化抗原或细胞功能性标志物出现时，它们的水平明显下降，说明二者均为干细胞分化早期的标记 [24]。Gronthos等[23]发现骨髓中STRO-1+细胞在培养中能够产生成纤维细胞克隆形成单位(CFU-F)，并且在诱导性成骨培养液中表达碱性磷酸酶、骨钙素，并出现矿化基质。矿化基质经Von Kossa染色、透射电镜及X线衍射分析证实为羟基磷灰石，为纯化的CFU-F在体外培养条件下能够进行成骨分化提供了直接的证据，也说明STRO-1为骨祖细胞早期的细胞标记之一。Oyajobi 等[25]在对STRO-1+的不死细胞系的研究中发现，未汇合的培养细胞可以用免疫方法检测到I类胶原、osteoprotin及甲状旁腺相关缩氨酸的存在，较晚出现的成骨细胞分化标志骨钙素及骨唾液酸糖蛋白均为阴性。但当单层生长的细胞建立细胞—细胞接触联系后，骨钙素开始表达，表明细胞—细胞接触联系可以成骨细胞分化成熟。Chen等[3]发现造血干细胞表面标记CD34+的细胞中含有骨祖细胞，并且在培养中能够成为形态和功能正常的成骨细胞。骨祖细胞在骨髓低密度单核细胞（LDMN）中存在比例为1/36,000，在CD34-细胞比例为1/33,000，而在选择的CD34+细胞中上升为1/5,000。该研究认为造血干细胞与MSCs有部分的重叠，表明二者有更密切的关系，或许它们拥有共同的细胞起源。
　　从应用的角度出发，在解决种子细胞的来源及分离富集以后，最大的问题就在于如何在既定的时限内即能增加其数量又能保证其质量，满足临床上骨组织工程和基因治疗的需要。这需要对骨祖细胞的细胞起源、增殖、分化的机制及其信号调节等细胞生物学的研究进一步发展。目前对基质干细胞的培养及应用研究较多，但对早期确定骨祖细胞仍无统一的标准的细胞标记物，使各研究之间缺乏连续性。从而影响了其发展速度。细胞扩增时间长以及异体细胞所引起的免疫排斥反应是影响骨组织工程临床应用的主要障碍。国内外造血干细胞的动员、体外扩增技术研究的发展十分迅速，大大促进了造血干细胞移植在临床上的应用。这一点值得广大从事骨组织工程学研究的基础和临床工作者注意。

参考文献
1.Friedlaender GE,Mankin HJ.Transplantation of osteochondral allografts. Annual Review Med 1984;35:311-24
2.Mankin HJ,Gebhardt MC,Tomford WW.The use of frozen cadaveric allografts in the management of patients with bone tumors of the extremities.Orthop Clin North Am 1987;18:275-289
3.Ohgushi H,Goldberg VM,Caplan AI.Repair of bone defects with marrow cells and porous ceramic:Experiments in rats.Acta Orthop Scand 1989;60: 334-339 
4.Breitbart AS,Grande DA,Kessler R,et al.Tissue engineered bone repair of calvarial defects using cultured periosteal cells.Plast Reconstr Surg 1998;101(3):567-74
5.Vacanti CA,Mikos AG.Letter from the editors.Tissue Eng 1995;1:1-2
6.Beresford JN,Gallagher JA,Russell RG.1,25-DihydroxyvitaminD3 and human bone-derived cells in vitro:effects on alkaline phosphatase,type I collagen and proliferation.Endocrinology 1986;119:1176-85
7.Robey PG.Collagenase-treated trabecular bone fragments:a reproducible source of cells in the osteoblastic lineage.Calcif Tissue Int 1995;56: s11-2
8.Jonsson KB,Frost A,Nilsson O,et al.Three isolation techniques for primary culture of human osteoblast-like cells.Acta Orthop Scand 1999;70(4):365-373
9.Malekzadeh-R,Hollinger-JO,Buck-D,et al.Isolation of human osteoblast-like cells and in vitro amplification for tissue engineering. J-Periodontol. 1998 Nov; 69(11): 1256-62
10.Malaval-L, Liu-F, Roche-P,et al.Kinetics of osteoprogenitor proliferation and osteoblast differentiation in vitro. J-Cell-Biochem. 1999 Sep 15; 74(4): 616-27
11.Uchida S, Doi Y, Kudo H, et al.Transient expression of activin betaA mRNA on osteoprogenitor cells in rat bone regeneration after drill-hole injury. Bone 2000 Jul 1;27(1):81-90
12.Oreffo-RO,Triffitt-JT.Future potentials for using osteogenic stem cells and biomaterials in orthopedics. Bone. 1999 Aug; 25(2 Suppl): 5S-9S 
13.Kadiyala S, Young RG, Thiede MA,et al. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell Transplant 1997 Mar-Apr;6(2):125-34
14.Caplan AI.Mesenchymal stem cells.J Orthop Res 1991;9:641-50
15.Maniatopoulous C,Sodek J,Melcher AH.Bone formation in vitro by stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats.Cell Tissue Res,1988;254:317-30
16.Jaiswal N,Haynesworth SE,Caplan AI,et al.Osteogenic differetiation of purified,culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro.J Cell Biochem 1997;64:295-312
17.Digirolamo CM,Stokes D,Colter D,et al.Propagation and senescenceof human marrow stromal cells in culture:a simple colony-forming assay identifies samples with the greatest potential to propagate and differentiate.Br J Haematol 1999;107(2):275-81
18.Bruder SP,Fox BS.Tissue engineering of bone:cell based strategies.Clin Orthop Related Res 1999 Oct;367S:S68-S83
19.Caplan AI,Brader SP.Cell and molecular engineering of bone regeneration. In:Lanza RP,Langer R,Chick WL.eds.Principle of tissue engineering.Austin:R.G.Landes Company;1997:603-18
20.Hugens SS,Hicks DK,O’keefe RJ et al.Shared phentypic expreession of osteoblasts and chondrocytes in frature callus.J Bone Miner Res, 1995; 10(4):533
21.邓廉夫,汤雪明,柴本甫等.肿瘤坏死因子-α和骨形态形成蛋白-2诱导成纤维细胞成骨表型表达的体外研究.中华修复重建外科杂志 1998;12(4):236-40
22.Park SR,Oreffo RO,Triffitt JT.Interconversion potential of cloned human marrow adipocytes in vitro.Bone 1999;24(6):549-554
23.Gronthos S,Graves SE,Ohta S,et al.The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic procursors.Blood 1994;84(12):4164-4173
24.CHEN J-L,Hunt P,Mcelvain M,et al.Osteoblast precursor cells are found in CD34+ cells from human bone morrow.Stem Cell 1997;15:368-77
25.Oyajobi BO, Lomri A,Hott M,et al.Isolation and characterization of human clonogenic osteoblast progenitors immunoselected from fetal bone marrow stroma using STRO-1 monoclonal antibody.J Bone Miner Res 1999 Mar;14(3):351-61

骨组织工程学种子细胞实验应用现状
作者单位：100700 北京市 北京军区总医院骨科