纯化蜂毒肽对兔免疫性关节炎的抑制作用
李亚非 时述山 李 欣 常红星 

摘要

目的：观察纯化的蜂毒肽对兔免疫性关节炎的病理过程是否有抑制作用。[材料与方法]采用柱层析方法纯化粗制蜂毒, 以除去具有溶血及化学刺激作用的杂质。纯化物经CD光谱法和荧光光谱法,高压液相色谱分析及氨基酸序列分析。造成家兔卵蛋白性关节炎模
型,给予蜂毒肽肌肉注射,观察组织炎症反应的变化。并测定兔血色素水平,进行了体外溶血实验。[结果]高压液相色谱分析显示单峰,CD光谱法和荧光光谱法,高压液相色谱分析氨基酸序列分析显示纯化物氨基酸序列与文献报导蜂毒肽一致。实验组应用纯化蜂毒肽后,滑膜炎症明显减轻。溶血实验显示纯化蜂毒肽的溶血作用较粗制蜂毒肽明显减轻。[结论]纯化蜂毒肽对兔免疫性关节炎具有良好抗炎作用,并且溶血作用较弱。 

关键词：蜂毒肽, 免疫, 骨关节炎,兔
作者单位 100700,北京军区总医院骨科 (李亚非 时述山 常红星);中国医学科学院上海药物研究所(李 欣)
类凤湿关节炎是一种常见疾患,病因尚不清楚,治疗比较困难。本研究采用天然蜂毒,经柱层析获得纯化蜂毒肽,实验证实纯化蜂毒肽对兔免疫性关节炎具有显著抑制作用。

材料与方法

1.动物模型 采用家兔卵蛋白性关节炎模型[1-4]。
1.1.动物及分组 成年新西兰兔20只,随机分为两组,A组(实验组) 1 0只,B组(对照组)10只。
1.2.免疫用完全性佐剂的制备 取羊毛脂5ml+液体石蜡10ml(1:2),加温至70-80℃,磁力或震荡器混匀,成为不完全佐剂。取不完全佐剂4ml加入旧结核菌素100单位/2ml,成为完全佐剂6ml, 磁力或震荡器混匀乳化,用前加入卵蛋白,成为3%卵蛋白溶液。
1.3.在兔背部肩胛骨间选5 个注射点 ,分别皮下注射完全佐剂0.5ml,致敏。致敏28天后,于兔右膝关节内注入不完全佐剂1.0ml。 注射后分笼饲养,观察兔肢体活动情况,膝关节肿胀度(卡钳测其宽度),皮肤温度。于50天,80天时各组处死5只取材, 包括双侧膝关节,肌肉,关节囊,滑膜,以4%多聚甲醛固定,10%EDTA脱钙,切片,HE染色,光镜下进行组织学检查。
2.纯化蜂毒制备
粗提蜂毒适量溶于HoAc/NaAc缓冲液中,离心除去不溶性杂质上清液经过Sephaden G-50F 柱,流速5ml/h,流动相为HoAc/NaAc 缓冲液,收集流出液,再经Sephaden G-15柱脱盐后,冷冻干燥。干燥样品溶于HoAc/NaAc缓冲液,经过Sephaden G-50F 柱, 收集主峰位处流出液,经过Sephaden G-50F柱,脱盐后,冷冻干燥。 纯化物经高压液相色谱分析,显示单峰。又经CD光谱法和荧光光谱法,高压液相色谱分析氨基酸序列分析, 显示提取物氨基酸序列与文献报导蜂毒肽氨基酸序列一致。得蜂毒肽纯品(详细方法将另外报导)。
3.给药方法 
纯化蜂毒以生理盐水溶解。在A组,于再次刺激后立即肌肉注射纯化蜂毒1mg,1/日,7天后未见不良反应,改为2mg,1/日肌肉注射,14天后改为3mg,1/日肌肉注射,直到处死。B组肌肉注射生理盐水。
4.纯化蜂毒肽的溶血实验[5]。 
A组兔处死前,取新鲜静脉血10ml,用竹签搅拌以除去纤维蛋白,再用生理盐水冲洗3-5次。每次加生理盐水5-10ml,混匀后离心, 弃上清液,再加入生理盐水,离心,直至上清液不呈红色为止。 然后按所得红细胞的容积,用生理盐水配制成2%的悬液。取试管7支,编号,按下表加入各种溶液,第6管不加供试品,作为空白对照。第7管不加供试品并用蒸馏水代替生理盐水,作为完全溶血对照。 轻轻摇匀后置37℃的水浴中保温后观察结果,作出判断。 纯化蜂毒肽以生理盐水配制成0.025%溶液

表. 纯化蜂毒肽溶血实验
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试 管 1 2 3 4 5 6 7
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蜂毒肽溶液ml 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 
生理盐水ml 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 2.5 蒸馏水2.5ml
2%红细胞悬液
ml
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判定标准
全溶血:溶液透明红色,管底无红细胞残留。
部分溶血:溶液透明,红色或棕色,底部尚有少量红细胞残留。 镜检红 细胞稀少或变性。
不溶血:红细胞全部下沉上层液体无色透明。镜检红细胞不粘集。
一般认为凡1小时后第3号管以及第3号以前的各管出现溶血、 部分溶血或凝集反应即判定为有溶血作用。
5.纯化蜂毒肽对家兔血色素水平的影响
于注射纯化蜂毒肽14,28,50,80天时,从兔耳静脉采血。二甲苯棉球涂擦兔耳,使血管扩张,针头刺破耳静脉,使血液自然流出,滴入放有抗凝剂的试管。血样以自动生化分析仪检测血色素水平, 各种血细胞数量。

结 果

1.大体观察 A、B两组再次刺激(关节内注射佐剂)后3-7天, 兔膝关节明显肿胀,宽度平均2.5Cm,行走时右后肢提起,不敢负重, 皮温高,颜色发红。 
经用药后,A组兔活动逐渐恢复如常,右膝关节红、肿、 热逐渐消退,组织无明显充血水肿现象。14天时,关节宽度2.0cm。80 天处死时,关节宽度1.8cm(正常对照关节宽度平均为1.5cm)。A组取材时发现,软组织水肿增厚不明显,肌肉色泽正常,关节腔内无积液。B组肌肉注射生理盐水,兔后肢活动持续受限,右膝关节红、 组织肿胀现象消退不明显。14天时,关节宽度2.4cm。80天处死时, 关节宽度2.2cm。B组取材时发现,软组织水肿,肌肉紫红,滑膜增厚,关节腔内有积液。
2.组织学检查:B组50天时滑膜充血、水肿、增厚变疏松,表面滑膜组织可见坏死灶有纤维素被覆。较多为淋巴细胞和浆细胞, 少量中性白细胞渗出(图 1)。80天时即慢性滑膜炎期, 滑膜内可见大量淋巴细胞和浆细胞浸润(图2)。 浅层淋巴细胞浸润为弥漫性和局灶性且围绕小血管周围。可以见到淋巴小结,成为生发中心样。80 天时病变内浆细胞明显增多。滑膜增厚,慢性炎症改变,内层成垂直状排列,形成多核巨细胞。滑膜细胞达4层以上,新生毛细血管增生。
在A组,50天时滑膜轻度增厚水肿,滑膜表面未见有纤维素被覆。 80天时滑膜下有散在炎细胞增生等反应,也为淋巴细胞浆细胞为主,数量及密集程度明显较B组轻(图4)。 滑膜内未见多核巨细胞,淋巴小结及大量新生血管。
3.纯化蜂毒肽溶血实验
保温1小时后第3号管以及第3号以前的各管未出现溶血、 部分溶血或凝集反应。3小时第5号管部分凝集, 镜检红细胞有粘集破坏现象。
4.纯化蜂毒肽对家兔血色素水平的影响
注射纯化蜂毒肽14,28天时,实验兔的血色素水平略低于对照组, 50,80天各个时间点,实验组对照家兔血色素水平,各种血细胞数量均无明显差异。

讨 论

本研究采用纯化蜂毒肽治疗了家兔卵蛋白性关节炎。一般认为,家兔卵蛋白性关节炎模型在病程病理变化方面接近人类类凤湿关节炎。[1-4]。
类凤湿病很常见,经常侵犯关节,病因尚不清楚。目前认为免疫出类凤湿因子(RF),它是免疫球蛋白形成的免疫复合物,被白细胞吞噬后发生脱颗粒,释放水解酶,引起局部炎症反应(5,6)。 免疫荧光法证明病变滑膜内有多种免疫复合物沉积。 患部滑膜淋巴小结浆细胞能产生RF。 随着炎症转为慢性,滑膜内T淋巴细胞和B淋巴细胞增多,形成多量浆细胞及免疫球蛋白。本实验可以见到B组淋巴小明显增多,有明显的慢性滑膜炎表现。 一般认为这是产生类凤湿因子的场所。[7-8]。A组在完全佐剂再次刺激后也出现典型关节炎表现,但是经纯化蜂毒肽治疗后关节肿胀迅速减轻,组织学检查, 滑膜只有轻度增厚水肿,滑膜表面未见组织坏死常有的纤维素被覆。 滑膜下也只有散在局灶淋巴细胞浆细胞增生,数量及密集程度明显较B组轻。说明纯化蜂毒肽对滑膜炎起到了显著的抑制作用。
目前引起本病的始动因子尚不清除,可能为感染因子,如病毒支原体等。这些因子进入体内后,它们的一些成分被滑膜细胞摄取,组合到滑膜细胞合成的蛋白多糖体中,使其发生改变,形成具有抗原性的物质即自身抗原。机体对自身抗原产生抗体, 形成抗原抗体复合物。但同时还可引起IgG结构的改变,形成新的显露的抗原簇, 激发而引起另一抗体形成,即RF。RF是IgM,它与改变了的 IgG 反应形成IgG-IgM免疫复合物。激活补体吸引中性白细胞和单核细胞,溶酶体水解酶释放,引起滑膜细胞坏死和关节软骨破坏,反复发作, 成为慢性炎症。[6-8]。本实验所采用免疫性动物关节炎模型,已往的研究证实该模型在病程及病理变化方面非常接近人类类凤湿病变, 经常被用来研究类凤湿关节病变。
蜂毒是很早以来人们就十分关注的天然毒性物质。用蜂毒治病在我国民间流传已久。1888年维也纳医学周刊也曾记载过奥地利医师用蜂毒治疗173例凤湿病的事实。蜂毒对某些疑难顽症,如凤湿、类凤湿关节炎、强直性脊柱炎、坐骨神经痛及肩周炎等都有独特疗效。[3]。
蜂毒成分复杂,除上述提到答的高分子量组分外,还含有生物活性肽 组织胺等小分子量物质 其中蜂毒肽(Melittin)是蜜蜂毒中主要活性物质约占干蜂毒的50%。对蜂毒肽的药理研究发现,蜂毒肽具有:1.蜂毒肽对多种革兰氏阴性和阳性菌有抑制作用,而且还能增强磺胺药和青霉素的作用,2. 蜂毒肽具有抗辐射作用可使受到辐射的动物存活率由0.5%增长至50%,3.蜂毒肽对某些实验性肿瘤有很好抑制作用,4.蜂毒肽还能刺激垂体-肾上腺皮质功能, 从而产生抗炎作用,5.蜂毒肽还可与人体内一种重要生理调节蛋白-钙调素有非常强的结合作用,因此蜂毒肽具有广泛临床价值。但是,蜂毒具有很强溶血活性,易引起患者的溶血性贫血;此外蜂毒还含有能引起过敏反应的透明质酸酶磷脂酶A(3)和酸性磷酸酶等大分子化合物 这些副作用限制了蜂毒在临床的广泛应用。本研究所得纯化物经高压液相色谱分析,显示单峰,说明分离效果良好,纯度高。 又经氨基酸序列分析,显示提取物氨基酸序列与文献报导蜂毒肽氨基酸序列一致。 结果显示,家兔肌肉注射蜂毒肽后,其血色素水平只有轻度下降, 大部分试管红细胞形态也未见明显变化,溶血作用明显减轻。 以上实验结果说明纯化蜂毒肽中引起溶血反应的物质可能大部分已被去除。本研究采用柱层析的方法,获得了纯化的蜂毒肽,经实验证实具有良好抗炎作用,但其作用机理尚待进一步研究。 纯化的蜂毒肽在临床可能有很大应用潜力。

参考文献
1.徐叔云,卞如濂,陈修,主编.药理学实验方法.第2版, 人民卫生出版社,北京,1991.
2.章元沛,主编.药理学实验.第2版,人民卫生出版社.北京,1996.
3.Stanley DS.,Jean-Louis S.,Charles M.,et al. Bee VenomMelittin Blocks Neutrophil Production.Inflammation, 1986,10:175.
4.ALi A.,Ali Al.Stimulated Chemiluminescence of Isolated Human Polymophonuclear Leukocytes:In Vitro Inhibition By Melittin.J Natural Toxins,1986,11:65.
5.Grimley DM,Sokoloff L.Synovial Giant Cells in Rheumatoid arthritis.Am J pathol 1966,49:931.
6.Bhan AK. Roy S. Synovial Giant Cells in Rheumatoid Arthritis and other Joint Disease.Ann Rheum Dis,1971. 30:294.
7.Wyllie JC.The fine Structure of Synovial Lining Cell in Rheumatoid Arthritis.Lab Invest,1966,15;519.
8. Fassender HK, Simmling- Annfeld. The potential aggressiveness of Synovial tissue in Rheumatoid Arthritis. J Pathol 1983,139:499.