退变颈椎间盘组织中骨形态发生蛋白的基因表达
李亚非 时述山 季新民 丁华野 

椎间盘退变以后，可能导致椎间盘膨出、突出。但椎间盘退变的原因及其过程中形态学改变、细胞分子机制尚不清楚。作者采用免疫组化和分子原位杂交的方法,研究了突出椎间盘组织中骨形态发生蛋白的基因表达,对其在颈椎间盘退变中可能起的作用进行了探讨。

1.材料与方法

1.1.病例:共33例，男21例,女12例,年龄36-72岁，平均55岁。标本为取自颈椎前路环锯钻孔减压术中颈椎骨-椎间盘组织。术前均有典型症状体征,并经CT或MRI检查证实椎间盘变性和突出。对照组7例,为18-31岁猝死健康人的颈椎骨-椎间盘组织。
1.2.标本处理:：手术用环钻取出的颈椎骨-椎间盘组织标本呈圆柱状。用Bouin液固定48小时，置入15％乙二胺四乙酸三钠溶液中脱钙,4℃,每周换液一次，持续21天完成脱钙。OCT包埋、冰冻切片。每例标本制备4um连续切片12张。6张切片H.E染色,常规镜检。另外6张用作免疫组化研究
1.3.免疫组化研究:BMP多克隆抗体由第四军医大学生化教研室提供，为抗人BMP2A基因表达产物的兔免疫血清，浓度为1:40，ABC试剂盒购自博士德公司。
BMP2A质粒由军事医学科学院基础所生化室惠赠,地高辛试剂盒为德国Boehringer Mannheim Biochemica 公司产品.
切片经脱蜡至水后，分别经甲醇～双氧水封闭内源酶，正常血清封闭非特性染色。最后按常规ABC法进行免疫组化染色。即切片经第一抗体(BMP多克隆抗体)处理过夜后，依次经生物素化第二抗体、ABC复合物处理30分钟，DAB显色。用PBS或兔非免疫血清代替一抗作为阴性对照。以人骨肉瘤组织作阳性对照。
1.4.原位杂交研究
探针的标记及原位杂交研究程序按地高辛试剂盒说明书进行.标记时,每微克BMP2A cDNA片段,分别加入2ul核苷酸六聚体混和液,2ul dNTP标记混和液及1ul Klenow酶,充分混匀,37℃反应20小时,最后乙醇收集沉淀.原位杂交时,切片经脱蜡至水后,0.2mol/L盐酸处理及蛋白酶消化,4%多聚甲醛固定30分钟,系列乙醇脱水.加杂交液反应20小时(40℃),依次经2XSSC,1XSSC,0.5XSSC溶液充分洗涤,加地高辛抗体,37℃,24-48小时,最后用碱性磷酸酶显色.对照组分别经DNA酶和RNA酶处理。
1．5．统计学分析，t检验。

2．结果 

2.1.组织学检查:33个标本中的26个椎间盘组织有不同程度的软骨细胞增殖，主要表现为邻近软骨板的椎间盘组织出现软骨细胞，突出的椎间盘边缘形成骨赘,与后纵韧带融合，显示软骨内化骨。纤维环板层消失,可观察到髓核的收缩和消失以及裂隙,纤维环的正常组织结构失去。
2.2. BMP免疫组化染色及分子原位杂交研究: 33个病例的标本及对照组标本的切片均做了BMP免疫组化染色及分子原位杂交。常规镜检有不同程度的软骨细胞增殖的标本，与软骨板相邻的椎体骨组织和椎间盘中的软骨细胞BMP免疫组化染色及分子原位杂交阳性。突出的椎间盘边缘形成的骨赘、后纵韧带及骨膜BMP免疫组化染色及分子原位杂交强阳性。自椎体骨和软骨板发出一些散在的呈"指状"的骨突嵌入椎间盘,其表面骨组织和周围的椎间盘组织BMP免疫组化染色及分子原位杂交阳性。突出的椎间盘中央BMP表达阴性。常规镜检未发现软骨细胞增殖的标本和对照组标，BMP免疫组化染色及分子原位杂交均为阴性。
2．3．统计学分析显示，突出椎间盘、骨赘、后纵韧带及骨膜BMP免疫组化染色及分子原位杂交阳性率有显著差异，p<0.05。。

3.讨 论

一般认为, 椎间盘椎间盘退变与突出有密切关系。髓核组织含水量减少，蛋白多糖丢失，引起纤维环松驰，椎间盘变窄，原有生物力学性质减退，不能将其所受的压力均匀向四周传播，造成椎间盘突出，并可引起椎体后缘骨赘增生，剌激韧带骨化。近年的研究发现间盘的退变、突出与软骨板的骨化有关，但细胞及分子机制尚不清楚。
种生长因子与细胞增殖与分化有关。生长因子在体内分导细胞间的生化反应，调控组织的发生、生长、再生，还可能加速某些异常变化。正常椎间盘组织中不应当有软骨细胞出现。以往的研究发现，在椎间盘变性早期，纤维环细胞增殖还具有组织特征，在变性进展期，这些细胞转化为软骨细胞，进而通过为软骨内化骨成为骨组织。(1)还发现切除小鼠颈椎的棘突和相关韧带，可导致颈椎间盘退变、软骨化骨发生。(2)提示椎间盘变性、突出和软骨增殖间有密切关系。(1-6)
BMP是一种存在于人和啮类动物骨基质间的酸性蛋白质，可诱导肌肉间隙、筋膜内间充质细胞分代成软骨，继而通过软骨内化骨转化成骨组织, (7) BMP是否存在并作用于椎间盘组织尚不清楚。
研究采用免疫组化及原位杂交技术, (8，9)观察BMP在正常和变性突出椎间盘组织中的表达。结果显示（1）突出的椎间盘边缘出现软骨细胞，代替了正常的梭形细胞，这些细胞BMP蛋白及mRNA表达阳性。在正常椎间盘纤维环及变性突出椎间盘的中心部分BMP及mRNA表达阴性。（2）椎间盘突出形成的骨赘BMP表达强阳性。与椎间盘突出部接触的后纵韧带和骨膜也有BMP的阳性表达。（3）软骨板BMP蛋白及mRNA表达阳性。（4）进一步的观察发现,自椎体终板发出了一些指状的骨性突起深入到椎间盘组织中,这些骨突及其周围的椎间盘组织BMP表达阳性。
上述现象提示退变突出的椎间盘中有BMP蛋白及其mRNA表达和成骨活动。但其来源似乎并非来自椎间盘细胞本身，而是来自上下软骨板、骨膜、韧带等组织的可能性大。这种BMP的激活的确切机制尚难以确定，它也可能是椎间盘退变突出后的结果。但BMP可在纤维组织中诱导软骨发生。椎间盘一旦有软骨组织形成、骨化发生，其脆性必然增加，正常机械力学特性会降低,因此可能诱发椎间盘突出或加速病变过程。不仅BMP，其它生长因子或细胞因子也可能与椎间盘变性有关。(1-6)应当认真研究这些因子在椎间盘变性和逆转过程中的作用，骨形态发生蛋白对椎间盘细胞作用的体外研究和生物力学实验也可能是需要的,结果可能明确骨生长因子在椎间盘退变过程中的作用。