神经肽对人成骨细胞生物学行为的影响
马文辉 李亚非 等

了解神经肽和骨形态发生蛋白（BMP）对成骨细胞增殖及代谢等细胞生物学行为方面的影响，为从细胞水平认识神经肽对骨组织的作用提供理论依据。

材料与方法

1．试剂：降钙素基因相关肽（CGRP），血管活性肠肽（VIP），神经肽Y（NPY），P物质（SP）均为美国Sigma公司产品。分别用无血清DMEM稀释成2.2μg/ml的浓度，过滤除菌后，封口膜封口，于-20OC冻存。人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）浓度为2.2μg/ml。PI染色剂终浓度为50μg/ml。RNA酶A终浓度为100μg/ml，
2．成骨细胞培养方法与鉴定：
2．1．取4月龄正常人胚胎四肢长骨，用剪刀剪成1-2mm3大小的骨块，按常规方法传代至有足够量初代细胞后应及时冻存。
2．2．成骨细胞生物学特性鉴定：
　　光镜、扫描电镜（SEM）观察细胞表面形态，超薄切片透射电镜（TEM）观察，Giemsa染色观察观察染色体并记数，Gomori钙钴法碱性磷酸酶（ALP）染色检测细胞内ALP，成骨细胞生成Ⅰ型胶原测定， 四环素荧光标记成骨细胞结节检测法。细胞外骨钙素（BPG）测定成骨细胞成骨性蛋白标志物的活性测定。
3．神经肽对成骨细胞增殖的影响：
3.1. 分组与处理: 取第2或3代生长活跃的成骨细胞接种于多块24孔板内，细胞浓度为105/ml左右。3-5天后观察孔内细胞长满并有重叠生长时，将24孔板随机分为6组，每组4孔。第1-5组分别在第3天加不同浓度NPY、NPY+ BMP、 SP、SP+ BMP、BMP，第六组为对照组，加DMEM。37 OC孵育24小时后，部分24板用于检测，另一部分24孔板更换成含15%FBS的DMEM，各组分别在第3天与第5天又两次加入以上各因子，5%CO2孵箱37 OC孵育24小时后，进行各种检测。
3.2.流式细胞仪检测:各孔细胞收集于试管，离心，70%酒精固定，RNA酶消化，加入PI溶液，离心，去上清，加入PBS打成细胞悬液，上机检测。每个样本计数约10000个细胞，测得的细胞周期图形使用机器自备的软件处理，计算出细胞在G0/G1期、G2+M期和S期的百分比，采用增殖指数（处于G2+M期和S期的细胞百分比）表示细胞增殖情况。
3.3.碱性磷酸酶（ALP）活性测定： 0.25%胰蛋白酶消化后,各孔细胞分别收集于不同的Eppendorf管中，加蒸馏水低渗，在液氮中反复冻融3-4次，破坏细胞膜，离心后取上清到全自动生化分析仪上检测，测量波长405nM。
3.4. 神经肽对成骨细胞合成骨钙素（BPG）的影响：将各孔培养液吸出，放入不同的Eppendorf管中，通过放射免疫法检测各孔中BPG的浓度。
以上实验结果用SAS软件包，通过多因素析因分析方法进行统计，并进行组间两两比较。

结 果

1. 成骨细胞的鉴定：在倒置显微镜下细胞具有成骨细胞特征。Giemsa染色细胞核嗜弱硷性，核仁明显，胞浆粉红色。扫描电镜观察：成骨细胞以长梭形为主，细胞有分泌颗粒。透射电镜观察：在原代培养的骨组织中可见细胞表面有粗而长的骨小管，骨细胞突起，细胞外有钙盐沉积在类骨质中。ALP染色后胞浆中有许多染成灰黑色的颗粒，表示酶含量较多。Ⅰ型胶原免疫组化染色后，可见成骨细胞经染色后呈棕色阳性反应。荧光显微镜下可见到四环素标记的黄色发光结节。成骨细胞骨钙素(BGP)测定表明骨钙素明显高于成纤维细胞(P<0.05).培养的成骨细胞染色体数为23对,均为二倍体,未发现异常染色体.提示正常人成骨细胞经培养和传代后仍能保持正常核型,未发生变异。
2．在24、48、72小时，各种肽及BMP可促进人成骨细胞增殖（P<0.01）。
3、统计分析表明，在各时间点，各种因子的促增殖作用相比较，NPY与VIP作用最强，并且两者之间无明显差别（P<0.05）；其他四种因子的作用无显著差别（P<0.05）。
4、各种肽类因子与BMP复合作用对人成骨细胞均有促进增殖作用（P<0.01），但是，在24、48小时，复合作用均较各因子单独作用的效果减弱。而在72小时，NPY、SP与BMP的复合作用均较它们单独作用的效果增强。

　　综上所述，我们可知各种肽类因子及BMP均可刺激人成骨细胞的增殖，其中NPY与VIP的效果最明显，并且其作用与浓度成反比，但是关于其最佳作用浓度尚需进一步摸索。

1、对结果的统计分析表明，不论加一次还是加两次因子，也不论是肽类因子单独作用还是与BMP联合作用，各组ALP值均高于对照组（P<0.05）。并且从结果与直方图可看出，二次加药后ALP增加的幅度较一次加药为大，其中尤以NPY单独作用下效果最为显著，说明两次加药后效果较一次加药有所加强。
2、无论是加一次或加两次因子，SP与NPY单独作用均较与BMP联合作用对ALP的影响明显，这一点与前面MTT实验中的结果是一致的。
3、高ALP是培养条件下成骨细胞的特征之一。其主要作用是由成骨细胞分泌到周围基质中，分解磷酸钙盐，使局部的磷脂和游离钙离子浓度增高；磷脂与钙离子有很强的亲和力，结合后沉积于类骨质，导致其迅速钙化成骨。因此ALP对于成骨细胞发挥成骨作用有重要意义。各种因子引起的细胞ALP活性的增高说明了它们具有促进成骨细胞成骨的作用。

神经肽对成骨细胞合成骨钙素（BPG）影响测定结果

1、对结果的统计分析表明，不论加一次还是加两次因子，也不论是肽类因子单独作用还是与BMP联合作用，各组BPG值均高于对照组（P<0.05）。并且从结果与直方图可看出，二次加药后BPG增加的幅度较一次加药为大，其中尤以NPY单独作用下效果最为显著，说明两次加药后效果较一次加药有所加强。
2、无论是加一次或加两次因子，SP与NPY单独作用均较与BMP联合作用对BPG的影响明显，这一点也与前面MTT实验中的结果是一致的。
3、BPG是成骨细胞合成的特异性蛋白质，其合成量的多少直接反映了成骨细胞活性的高低。因此各种因子促进细胞BPG的合成，表明了它们能够增加成骨细胞的活性，进而发挥其成骨效能。

讨论

　　大量的临床与实验观察表明：骨的生长、修复与再建均受神经系统的调控[11]。对哺乳动物进行的绝大多数研究均显示，通过手术或化学方法去神经支配的动物，尽管骨矿物沉着和结构可能发生改变，但骨的生长几乎不发生变化。在人类，Glem观察到大脑损伤可刺激骨痂形成与骨折愈合。但是Dyck却认为去神经支配是引起骨折不连和延迟愈合的原因。尽管各学者的研究结果有相驳之处，但是神经系统对于骨生理、病理的调节作用已是公认的事实。

　　目前已发现的参与骨组织调节的神经肽类有CGRP、NPY、VIP、SP、TH五种。其中，对于CGRP的研究最广泛而深入。已发现有两种降钙素基因即α、β基因，它们分别编码CGRP-α与CGRP-β，而CGRP-β并不象CGRP-α一样具有成骨效应[12]。CGRP纤维在骨中分布最为丰富，其主要作用有以下几点：①CGRP是目前已知最有效的血管扩张剂之一[13]，可参与骨局部血流的生理调节，与炎症因子一起协同诱导局部水肿的产生。②CGRP有刺激成骨的作用。Bernard[14]发现CGRP在体外可刺激骨集落的增加。③Zaidi等报道CGRP还可抑制破骨细胞的骨吸收作用。正常人血液循环中存在微量的CGRP，但是由于其作用于骨的有效浓度明显高于循环中的血浆浓度，因此认为CGRP可能是作为一个局部因素来调节骨细胞的功能的。

　　关于SP，Hill等[15]发现其与CGRP共同存在于骨、骨髓、骺板、韧带及肌肉中，但CGRP纤维相对更为丰富。并且在骨中，两者共同分布于骨发生活跃的部位。另外Chung等[16]揭示了SP也有刺激成骨的能力，只不过其效应较CGRP为低。从而证实了SP象CGRP一样是骨干细胞有丝分裂和/或骨细胞功能的局部调节因子。VIP纤维绝大部分分布于骨膜，在骨内主要分布于骨髓与骨骺，其分布与血管无关。VIP在体外可有效地刺激骨吸收，同CGRP一样其循环浓度低于它作用于骨的有效浓度，因此VIP也是骨代谢的局部调节因子。TH是儿茶酚胺生物合成的关键酶，Bjurholm[17]通过对TH的阳性染色发现了骨中儿茶酚胺类（如去甲肾上腺素（NA））神经纤维的存在。在骨中NPY与TH神经共同存在于接近生长板的骨骺区和骨髓中，并与血管分布相关。NPY与NA是强有力的血管收缩剂，共同调节骨组织的血流量。

　　以上对于五种肽类物质的研究绝大部分是在组织水平进行的，而在细胞水平，尤其具体到某一类型的细胞深入研究五种肽的作用的报道非常少。Bjurholm等[18]利用成骨样细胞UMR106进行的研究表明细胞表面具有CGRP、VIP、NPY、NA、PTH的受体，从而说明这些肽类可通过受体对细胞产生影响。Cranford等[19]报道CGRP可引起成骨细胞cAMP的动态升高。Hohmann等[20]的实验表明VIP可通过cAMP 依赖机制引起骨吸收，并进一步推测，这种效应是通过作用于成骨细胞受体，而后引起成骨细胞与破骨细胞之间的动态相互作用发生变化，最后导致的骨吸收。

　　由于不同物种之间的种系差异，因此各实验结果存在不同程度的差别，不能完全用来解释人类骨生理、病理上的现象。另外，利用肿瘤来源的成骨细胞系进行研究得出的结论也有一定的局限性。因此本研究采用了正常人的成骨细胞，系统性地研究了五种肽对于成骨细胞生物学行为的影响。结果表明各种肽类物质均能不同程度地引起正常人成骨细胞的增殖，其中以NPY与VIP的效应最强，另外几种肽的作用无明显差异。各种肽分别进行了三种浓度的实验，结果均表明0.02ng/ml的浓度作用最强。可以认为它们的最佳作用浓度在10-2数量级附近，为进一步探讨各种肽的最佳效应浓度提供了依据。根据MTT的结果，本研究着重探讨了以往研究较少的NPY和SP两种肽类因子对人成骨细胞主要生物学特征的影响。结果显示了它们均能引起成骨细胞特异性蛋白标志物—骨钙素（BPG）及ALP活性的增高。从而证明两者均能增强成骨细胞活性，提高其成骨能力。当然，在体内的成骨过程是一个依赖于成骨细胞与破骨细胞活性的复杂的动态过程。但是以上的发现还是可以从一个侧面对肽类物质促进成骨的现象作出解释。这无疑是对骨组织的神经调控理论是一个必要的补充。另外，此研究中还显示两次使用肽类因子较一次使用的效果均有所增加，表明重复用药后会增加其对成骨细胞的促进效果，这对于以后进一步研究把肽类因子作为药物在临床中用来促进成骨有一定的意义。

　　BMP是一个公认的促成骨因子，并已应用于临床促进骨缺损的修复与愈合。在此研究中，BMP对正常人成骨细胞作用的结果是：其可促进成骨细胞增殖和分化，并且使细胞的BPG与ALP增加。从而在细胞水平解释了其成骨效能。我们还发现其成骨效能是与其浓度呈正相关的；两次用药后效应也会增加，这对于其现在的临床应用具有有益的指导意义。在此实验中我们还首次把五种肽类因子与已确认的成骨因子BMP联合应用于成骨细胞，结果表明复合作用均较各种因子单独作用时的效应有程度不同的减低。由于各种因子可能是通过受体发挥作用的，而关于它们受体的特异性方面未见报道，因此初步考虑上述现象是否是因为各因子作用于受体时具有相互拮抗作用而引起的，这有待于近一步的实验来证实。