基质干细胞经皮回植修复骨缺损的实验研究
常红星 李亚非 北京军区总医院骨科

摘要

目的：观察可成骨分化的兔基质干细胞经皮注射到骨缺损处后的成骨能力。方法 20只新西兰兔经坐骨结节穿刺抽取骨髓约1ml，肝素抗凝，按有核细胞数以106/cm2接种于25cm2细胞培养瓶中，37oC、5%CO2培养至细胞数达106个；将新西兰兔双侧桡骨干中段去除15mm皮质及骨膜，造成骨缺损，术后24h经皮注射经体外扩增的基质干细胞悬液0.5ml（细胞数约106+BMP100ng），分别于2、4、8、12周行X线、组织病理学检查，12周组进行生物力学检测。结果 术后2周BMP+MSC 组有明显的骨组织生成，与对照组有显著性差异（p＜0.01）。结论 在BMP存在下MSCs在兔桡骨缺损处能够较快形成新骨，修复骨缺损。

骨修复一直是困扰着矫形外科医生的一个难题，每年都有大量的病人需要手术修复由急性创伤、先天性畸形、良性和恶性肿瘤、骨感染及骨折不愈合所导致的大块骨缺损，新鲜自体骨及红骨髓因含有骨祖细胞（osteoprogenitor cells）而成为修复骨缺损、重建功能的一种常用手术方法，但有数量有限，增加手术创伤的缺点。骨组织工程学的发展为治疗提供了新的思路，本实验应用体外培养扩增的兔骨髓基质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）经皮回植到骨缺损处，来证明其在体内的成骨作用，为临床应用提供实验依据。

材料与方法

一、主要试剂和仪器
1、CO2培养箱：Hereus BB 5060型 上海市德国Hereus公司
2、倒置显微镜：Olympus IX70型 日本Olympus公司
3、培养皿及多孔培养板：丹麦NUNCLON公司
4、DMEM培养基：美国Gibco公司 高糖型
5、胎牛血清：天津TBD生物技术发展中心
6、rhBMP：购自北京百灵克生物科技公司

二、实验方法与步骤
1、细胞培养
新西兰兔18只，体重2.0-2.5kg，雌雄不限，分别麻醉后于坐骨结节穿刺，抽取骨髓1.0ml，肝素抗凝，做骨髓内有核细胞计数，以1×106个/cm2有核细胞密度接种于35mm塑料培养皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液做原代培养（37oC、5%CO2、饱和湿度），接种后第4天换液一次去除悬浮细胞，此后每2-3天换液一次。大约10-18天长满，细胞数达到106时即可使用。细胞回植前，用0.25%胰蛋白酶+1%EDTA在37oC消化5分钟，加入含血清DMEM培养液终止消化，800转/分离心10分钟，弃上清，加入0.5ml培养液充分吹打，并加入rhBMP100ng，制成MSC悬液备用。
2、兔骨缺损模型
18只新西兰兔随机分为2组。麻醉后，消毒铺单，经双侧前内侧切口切开，充分显露桡骨中段，用牙钻去除桡骨干15mm（包括骨膜），共制成骨缺损模型36侧。术后24小时后，用1ml注射器经皮穿刺到骨缺损处，分别植入MSC—红骨髓、MSC—生理盐水。实验动物分别于术后2、4、8、12周分批处死取材行相关检查。
3、X线检查
动物均于麻醉下拍双侧前肢正位X线片，投射条件为46kV，3.2mAs，焦距60cm。1）按Delloye等[1]方法（表1）根据X线显示骨缺损处骨痂生成情况及标本骨缺损处物理运动情况计分。2）用ImageJ软件（下载自http://rsb.info.nih.gov/ij/ ）计算骨缺损处的平均密度，为方便起见，均以相同面积的骨缺损处密度与近侧正常桡骨干密度的比值来计算。
4、生物力学检测
第8、12周组标本行
5、组织学检查
标本用10%中性福尔马林固定，脱钙、冲洗、石蜡包埋，沿骨纵轴切片。HE染色每一标本切取4张，取其中一张，按Nilsson等方法，根据光镜下所见的断端连接、骨痂形成和骨髓的出现等情况计分。
6、统计学方法
分组随机数由STATA软件产生。实验数据均采用STATA软件包处理，通过方差分析作显著性检验。

结 果

一、细胞形态学观察
细胞形态与第一部分实验相同。但不同个体间骨髓形成集落的个数及细胞生长速度均有明显的不同。
二、X线结果
A组：2周后可见骨缺损区有模糊的密度增高影，4周在骨缺损区出现新骨，可见明显的骨痂连接骨断端，8周时大多数桡骨断端骨桥连接，两端附近有髓腔形成，部分髓腔再通，仅有再生皮质骨与正常不同（照片22）。
B组：2周X线与术后无明显差异，4周部分可见骨痂，量较少，8周时有2侧达骨性愈合，其余髓腔封闭，部分断端与尺骨愈合（照片24）。
C组：骨缺损区始终无骨痂生长，4周后断端髓腔封闭（照片23）。
各组不同时期X线片骨痂密度见表7。
三、组织学观察
A组：术后2周骨缺损区域可见明显新生骨和软骨（照片16），并可见到纤维束间骨母细胞直接成骨，无炎性细胞浸润， 4周时骨缺损区内有较成熟新骨及骨髓出现，骨小梁形成明显（照片18），8周断端骨性愈合（照片19），骨痂大部改建，已有明显的皮质骨形成，髓腔与骨髓出现，部分与桡骨髓腔再通。
B组：2周时缺损区可见散在软骨岛（照片15），4周时骨缺损区大部为纤维组织，可见到散在新生骨，部分骨痂生长明显（照片17），8周愈合的2侧髓腔细小，大部为编织骨。
C组：骨缺损区由细胞密集的纤维组织和周围的肌腱充填，未能形成骨性连接（照片20，21）。评分结果见表8。

表7 不同时期骨痂密度比值
组别 2周(n=3) 4周(n=5) 8周(n=5)
A 0.677±0.089 0.961±0.261 1.080±0.241
B 0.580±0.062 0.660±0.051 0.801±0.116
P值 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 

表8 组织学评分
组别 2周(n=3) 4周(n=5) 8周(n=5)
A 3.67±0.577 5.60±2.793 9.60±1.517
B 1.33±0.577 3.00±1.732 5.60±3.130
P值 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05


讨 论

一、骨折治疗与MSCs体内成骨的可行性

骨折、骨折延迟愈合骨不连的治疗是骨科临床研究的重要课题。过去认为骨折局部血循环不良是形成骨不连的重要原因。近年研究则认为骨折区成骨细胞减少、活性降低、骨生长因子的缺乏是妨碍骨折愈合的重要原因之一。
临床常可见到部分骨折患者手术内固定后，尽管断端稳定，但骨痂却长期生长不良，发生延迟愈合，进而断端吸收，发展为骨不连。骨不连患者患者多次手术植骨内固定失败，植骨吸收，骨折端硬化，病理切片显示断端骨细胞稀少或死骨样改变，体外实验显示骨折愈合障碍区成骨细胞增殖能力低，骨钙素和ALP活性低，提示成骨活性的抑制。
临床治疗常用各种材料（脱钙骨基质、脱蛋白骨粉，磷酸钙生物陶瓷、羟基磷灰石、钛纤维等无机材料，聚乳酸、聚乙醇酸等有机合成可降解聚合物等等）已进行了数十年的实验与临床应用研究，虽可以填充骨缺损，却始终无法解决局部成骨细胞数量不足、活性降低的问题。同时，这些材料均需要采用手术的方法植入，无法避免手术带来的创伤、感染、影响关节和肌肉功能的问题。如果能够采用微创的方法将成骨类细胞直接输送到骨修复区，无疑对提高骨修复效果有重要临床意义，也符合当今微创外科治疗的趋势。
临床上利用红骨髓治疗骨缺损、骨不连就是这种尝试的实际应用。红骨髓植入治疗骨折已有多年的历史。采用自体骨髓基质细胞避开了免疫排斥反应这一难题，也没有伦理学方面的障碍，具有临床使用可能性。最早可以追溯到Goujon（1869）首先报道骨髓的异位成骨作用。Friedenstein[46]和Budenz[47] 分别在1976年和1980年证实骨髓细胞确实能分化为骨与软骨细胞。此后，学者们陆续采用骨髓单独或复合DBM(脱钙骨基质)粉注射，PLA-PEG复合BMP，单独注射DBM粉等促进动物骨折愈合，临床应用也取得一定效果[48,49,50,51]。但近来有研究者的实验发现骨髓的成骨能力不高[52,53,54]，我们也进行了注射自体红骨髓促进骨折修复的临床应用，部分取得较好效果。存在的问题主要是，骨髓的成骨效果由其中的基质细胞数量决定，骨髓中基质细胞非常有限（＜1/105有核细胞），细胞密度过低使单纯骨髓移植的成骨能力受到限制。对较大骨骼，注射的量小效果不够满意，要增加细胞数量，必须增加骨髓移植量，抽取骨髓量超过10ml，则需要多处穿刺，不仅增加病人的痛苦，而且骨髓的体积及流动性决定了局部很难聚集高浓度的、有成骨作用的细胞，因此在临床上应用有一定困难。
近二十年来，随着生物材料、干细胞分离培养技术的发展，组织工程学再造组织的出现为骨修复提供了新的方法。骨组织工程需要三方面因素的综合作用：首先是能够生成新组织的细胞成分；其次须存在生长及分化因子来诱导细胞成分适当生长与分化为目标组织，这些因子可以是外源性的，如纯化蛋白或移植细胞的产物，也可是内源性的，如来源于细胞外基质和分泌细胞。最后是可供细胞粘附、增殖和分化的基质成分。骨组织工程的种子细胞已得到广泛的研究与实验应用[55]，目前骨髓基质细胞的分离、培养与扩增技术日趋成熟，使其应用成为可能，经过短期（2-3代）的培养就可以得到足量的骨祖细胞（30-50×106）来进行骨缺损的修复，更有效的增加了骨祖细胞的数量，又不影响细胞的成骨能力。为骨缺损的治疗提供了更光明的前景。
MSCs作为骨组织工程学中最常用的种子细胞，从90年代开始得到广泛的研究和应用。国外有人将大白鼠、犬和人的MSCs在体外培养扩增后种植于羟基磷灰石/磷酸三钙载体，分别将其植入同基因的鼠、犬和去胸腺大白鼠体内，成功地修复了标准的股骨干骨缺损[56]，表明利用MSCs的组织再生治疗在临床上具有可行性。国内也有类似MSC与支架材料复合应用的研究[57,58]，其疗效已得到充分地肯定。
本实验采用了标准的动物长骨骨缺损模型，来观察MSCs经皮回植对骨缺损愈合的促进作用，骨缺损设为15mm，空白对照组在术后8周仍无明显骨痂形成，排除了自行愈合的可能。X线显示大部分实验侧经植入MSCs后在较短时间内骨缺损形成了骨性桥接，而注射骨髓侧虽有骨痂出现，但速度慢，数量少，新骨量与反映骨缺损愈合程度的骨痂密度比值均显著高于骨髓组。组织学显示MSCs组软骨内成骨与骨祖细胞直接成骨同时存在，新骨出现、骨改建和骨髓成熟度等指标综合评分也优于骨髓组，充分证明体外扩增的MSCs在体内具有优良成骨效果。在相同体积和条件下，体外扩增诱导的细胞较新鲜红骨髓有更强大的成骨能力。 

二、细胞组织工程的修复机制
虽然MSC体内移植后其成骨的生物学过程尚不明确，但将MSC与外源性生长因子复合使用，应能加快细胞分化成骨的速度，缩短骨愈合时间。以往研究表明，骨基质及局部形成的血肿中含有BMP等骨源性生长因子，能发挥诱导成骨的作用[59]。还有的研究将BMP、TGF的基因转染入骨髓基质细胞，发挥促进分化和增殖作用。但这种方法生长因子的表达还不够稳定、持久，方法也较复杂，临床推广应用有一定困难。
在本实验的前期研究中[70]发现，BMP等生长因子能够显著加强体外培养人成骨细胞及MSC的胞间通讯水平，提高细胞增殖和ALP活性。提示BMP等生长因子可通过增强细胞通讯而调节成骨细胞的生物学行为如增殖、分化的一致性，使一个群体的细胞同时进入增殖期，即所谓同步化现象。这种结果发挥成骨细胞的作用是极为重要的。因为只有当骨修复区域局部大多数成骨细胞处于活跃的增殖期时，形成真正有修复效果价值的骨痂才有可能。该研究为后续研究提供了基础。但由于为体外实验，在复杂的体内环境中，尚不能确定BMP促进细胞通讯作用的这些作用是否还存在，是否对MSC的增殖分化成骨作用有促进作用。