国家自然基金课题
----肽能神经因素影响骨修复机理的研究
李亚非 姚建华 马文辉 时述山 常红星 郑永军 丁华野 张立仁 李增洲

摘要目的：探讨肽能神经因素对脊髓损伤+胫骨骨折模型骨痂生成量和改建的影响及其机理。

材料与方法：
建立大鼠脊髓横断损伤+胫骨骨折模型，免疫组化方法观察了：

1. 骨痂降钙素基因相关肽（CGRP）、P物质（SP）、小肠血管活性肽（VIP）、甘丙肽（GAL）、神经肽Y（NPY）肽能神经分布、性质、数量的变化；

2. 放免法测定血清中上述神经肽的表达及其与骨痂形成的关系；

3. 成骨细胞表面神经肽受体的种类和分布；

4. CGRP、SP、 NPY、骨形态发生蛋白（BMP）、脊髓损伤动物分离血清对培养下成骨细胞生物学行为的影响。

结果：

1. 动物模型早期外骨膜中神经纤维数量增加、成骨细胞神经肽强阳性表达，骨痂量增多，但骨痂成熟迟缓；

2. 脊髓损伤+胫骨骨折模型早期血清中多种神经肽的水平出现变化，分离血清对培养下成骨细胞显示刺激骨钙素和ALP水平增高作用；

3. 人和大鼠成骨细胞表面有CGRP、SP、VIP、NPY和TH等神经肽受体分布；

4. 多种神经肽使成骨细胞间通讯水平，使细胞增殖速率和增殖期细胞比例增加。

结论：
在脊髓损伤+胫骨骨折模型，骨痂和血清中的神经肽CGRP、NPY、VIP表达出现明显变化，可能通过局部和全身两条途径作用于成骨细胞受体，以胞间通讯加强的方式调节成骨细胞生物学行为，使骨折局部早期成骨活动增强。

作者单位：北京军区总医院骨科（李亚非 时述山 姚建华 马文辉 常红星 郑永军 张立仁 李增洲），北京军区总医院病理科（丁华野），100700，北京。

国家自然基金课题（39770745）
内容缩略（有兴趣者请来Email联系）

长久以来已经注意到神经因素可以影响骨代谢，比如颅脑或脊髓损伤后出现的异位骨化、大量骨痂形成、骨折愈合的加快等现象，但注意力主要放在采用药物或放射线抑制这种有害的过多骨痂形成，对其机理的研究还不多[1-3]。
神经肽是广泛存在于人体中枢、周围神经及其它组织中的活性肽，是沟通细胞间与器官间的重要化学信使，有神经递质、神经调质和激素样作用[1-3,]。本研究从整体、局部、体外比较系统的探讨了肽能神经因素对骨修复的影响。证实在中枢神经损伤-血清和局部神经肽表达-成骨细胞表面受体-成骨细胞生化和形态改变之间存在着一条联系轴线。

（一） 关于中枢神经损伤合并骨折的动物模型的建立
以往国外采用周围神经损伤模型来研究神经因素对骨修复的影响，植物神经仍可沿血管周围到达并支配下肢并长入骨痂中[11-13]。因此是一种不完全的失神经胫骨骨折修复模型。为了最大限度减少植物神经的影响，我们首次建立了脊髓横断损伤+胫骨骨折动物模型进行研究。脊髓横断损伤平面选择在T10-11段，不仅可以损伤下肢的感觉、运动神经纤维，也可损伤分布于下肢的腰骶交感神经，使下肢失神经程度较单独切断坐骨神经和股神经高，反映神经因素对骨修复的影响的准确性提高。模型的早期成骨能力增强，骨痂生成增多，这与临床观察到的脑外伤脊髓损伤后易出现异位骨化骨痂增多现象相符。由于在脊髓损伤平面以下存在低级反射中枢，脊髓背根神经节内的神经元尚有较多存活，它们仍可能产生CGRP和SP，对骨折局部起作用，这需要进一步检测脊髓损伤平面以下背根神经节内CGRP和SP的变化。如有可能建立骨折完全失神经支配的模型，以了解在完全没有周围神经支配条件下对骨折愈合的影响。

（二）肽能神经因素影响骨痂形成的机理
本实验显示:

1. 中枢神经创伤后早期血清中多种神经肽CGRP、NPY、SP和VIP等水平增高

2. 动物模型的血清对培养下成骨细胞显示刺激骨钙素和ALP水平增高作用

3. 动物模型早期外骨膜增厚明显，骨痂骨祖细胞、成骨细胞胞浆内神经肽强阳性表达

4. 动物模型骨痂量增多，骨折愈合加快

5. 人和大鼠成骨细胞表面有CGRP、SP、VIP、NPY和TH等神经肽受体分布

6. 多种神经肽通过改变成骨细胞间通讯水平，使细胞增殖速率和增殖期细胞比例增加

研究结果提示中枢神经创伤可以使局部和血清中的神经肽表达出现变化，虽然释放的机理和来源途径尚需进一步研究，但显然神经肽可能先做用于成骨细胞的表面受体引起一系列形态和生化变化。
为何动物模型晚期血清及骨痂中神经肽的表达又变得差异不显著？如何解释动物模型大量纤维骨痂和软骨骨痂形成，骨痂停滞在纤维骨痂和软骨骨痂阶段，骨化障碍？研究提示中枢神经系统的创伤和应激反应造成神经肽表达的变化，血清中多种神经肽类水平增高，刺激成骨细胞前质细胞、成骨细胞的活性和增殖，与骨折局部肽能神经纤维数量增加的因素一起，早期使骨痂量增多。机制可能是神经肽类通过体液和局部作用于成骨细胞表面的神经肽受体，引起细胞胞间通讯的改变，引起细胞内一系列代谢改变，形成大量纤维骨痂和软骨骨痂。晚期血清神经肽表达降低与及骨痂的失神经支配，缺乏应力刺激，塑性障碍，使骨痂停滞在纤维骨痂和软骨骨痂阶段，骨化障碍。研究结果对于解释临床中枢神经损伤时大量的骨痂形成或以异位骨化的形成有价值。提示神经肽这条途径，促进骨痂生成达到促进骨折愈合的可能性，或抑制某些病理性的过多骨痂形成。

（三）神经肽对成骨细胞生物学行为的影响。
1．神经肽对成骨细胞增殖的影响：研究结果显示，不同浓度的神经肽CGRP、SP、VIP、NPY及BMP与成骨细胞共同培养，多次加药刺激，均对成骨细胞有刺激，以0.02μg/ml NPY最为明显，二次加药后ALP、BGP增加幅度大。经神经肽作用后，流式细胞仪监测处于增殖周期的细胞比例增加。提示神经肽对成骨细胞的促进增殖作用以及对细胞生物学同步性的影响[14-18,]。由于在骨痂中发现与BMP与神经肽成正比例的同时表达，提示神经肽与骨生长因子BMP的协同作用，但是其确切机理尚需进一步研究。初步摸索出了作用最强的神经肽组合和最佳浓度，以0.02μg/ml浓度NPY对促进成骨细胞增殖最显著。研究结果有利于阐明神经肽和骨生长因子类对成骨细胞的作用机理，并且为采用神经肽和骨生长因子类促进成骨细胞增殖提供了借鉴经验。
2．神经肽类加强成骨细胞胞间通讯的作用及其意义：激光共聚焦显微镜技术可在亚细胞水平研究诸如Ca2+,pH，cAMP和膜电位生理信号，对细胞形态实时动态监测，了解细胞间物质的定性运动，通过反映细胞间通讯水平了解代谢和功能的变化。本研究显示，受NPY、SP、VIP及BMP作用后，缝隙介导的胞间通讯水平得到不同程度加强，以0.02μg/ml浓度NPY对胞间通讯增加最显著。与前面所提NPY明显促进成骨细胞增殖的结果一致。结合上述流式细胞仪检测发现处于增殖周期细胞比例增加的现象，提示神经肽可以加强胞间通讯，使细胞个体之间沟通信息的增强，生物学行为趋于一致，提高细胞对各种因素刺激反应的一致性。继续深入研究本现象，可能有利于解决骨组织工程学研究成骨细胞增殖速度慢的难题。
由于神经肽类物质可以通过体液和局部作用调节骨代谢，引起细胞内一系列代谢以及形态改变[19-21]，那么肽能神经因素是否会通过神经体液因素影响某些骨科疾患其发生发展？可以进一步沿肽能神经对骨修复影响这条途径对这些疾患的发生和治疗进行研究。如果结果是肯定的，那么通过促进体内某些神经肽的生成，或利用外源性的某些神经肽，达到预防或治疗某些疾病的目的。比如可以利用某些肽类促进成骨细胞的增殖，达到促进骨修复的目的，或抑制某些神经肽的生成或肽拮抗剂，防止有害的、过多的骨痂生成，如脑外伤脊髓损伤后、人工关节置换后的关节周围异位骨化的防治。神经因素对骨代谢的影响，还有大量的工作要做。