骨髓基质干细胞的分离、鉴定、贮存、复苏技术
李亚非 马文辉

本研究在大量参考国内外学者培养方法的基础上,为了最大限度地减少细胞间的污染,提高成活率,建立一个可靠的正常人成骨细胞系,在许多方面进行了行之有效的改进。

成骨细胞的生物学特征

通过改良后的方法培养的细胞有很好的贴壁率与成活率,悬浮细胞一般4-6小时内可贴壁,细胞生长良好、增殖旺盛,培养3-5天即可传代。光镜下观察细胞形态均匀一致,未见其它形态的细胞污染,并且具有国内外研究人员报道的成骨细胞的形态特征:细胞呈梭形或多边形,胞质透明,单个核,呈卵圆形,偏于一侧,核仁明显。因此,从形态学方面提示了本法的优越性和可靠性。

本实验结果显示:

  • ALP染色可见胞浆中含有大量的灰黑色颗粒,某些部位染成黑色,说明ALP含量较高。定量分析细胞内的ALP含量显示,此细胞明显高于成纤维细胞。

  • 放免法测定此培养细胞合成骨钙素也明显高于成纤维细胞。

  • 细胞免疫组化染色表明其主要合成Ⅰ型胶原。

以上结果证明本法培养的细胞具有人成骨细胞的主要生物学特征。

本研究中细胞传代至少15次,多次传代后细胞的形态与生长情况无明显变化,生物学特征稳定。并且通过染色体分析表明,其具有23对染色体,未发现异常染色体;从而证实了其为正常人体来源的细胞,经培养与多次传代后仍保持正常,未发生变异。通过使用对新生骨有特异性的荧光染料―四环素进行染色标记,证实了此培养细胞具有成骨能力,从而从另一侧面证明了本细胞具有成骨细胞表型。此外,我们还对培养的细胞进行了冻存与复苏的研究,结果显示冻存后的细胞可长时间保存,并且复苏后仍具有上述稳定的生物学行为。

综上所述,本实验培养的细胞具有成骨细胞的形态和生物学特征;有良好的生长与增殖能力;经多次传代与冻融后其各种生物学行为保持稳定;并且始终保持人类细胞的核型,未发生染色体变异。本方法建立的细胞系产量大、周期短,因此可为临床骨生理与病理研究提供充足的、可靠的体外实验模型。另外,建立稳定的可冻存的人成骨细胞系,不仅对于骨组织工程修复创伤、感染、肿瘤所造成的大块骨缺损的研究具有重要意义。并且在教学和科研中可减少多次原代培养的麻烦,对于节省时间、经费,保证实验顺利进行提供了可靠的物质保证。

 

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