骨髓基质干细胞的分离、鉴定、贮存、复苏技术
李亚非 马文辉

本研究在大量参考国内外学者培养方法的基础上，为了最大限度地减少细胞间的污染，提高成活率，建立一个可靠的正常人成骨细胞系，在许多方面进行了行之有效的改进。

成骨细胞的生物学特征

通过改良后的方法培养的细胞有很好的贴壁率与成活率，悬浮细胞一般4-6小时内可贴壁，细胞生长良好、增殖旺盛，培养3-5天即可传代。光镜下观察细胞形态均匀一致，未见其它形态的细胞污染，并且具有国内外研究人员报道的成骨细胞的形态特征：细胞呈梭形或多边形，胞质透明，单个核，呈卵圆形，偏于一侧，核仁明显。因此，从形态学方面提示了本法的优越性和可靠性。

本实验结果显示：

• ALP染色可见胞浆中含有大量的灰黑色颗粒，某些部位染成黑色，说明ALP含量较高。定量分析细胞内的ALP含量显示，此细胞明显高于成纤维细胞。

• 放免法测定此培养细胞合成骨钙素也明显高于成纤维细胞。

• 细胞免疫组化染色表明其主要合成Ⅰ型胶原。

以上结果证明本法培养的细胞具有人成骨细胞的主要生物学特征。

本研究中细胞传代至少15次，多次传代后细胞的形态与生长情况无明显变化，生物学特征稳定。并且通过染色体分析表明，其具有23对染色体，未发现异常染色体；从而证实了其为正常人体来源的细胞，经培养与多次传代后仍保持正常，未发生变异。通过使用对新生骨有特异性的荧光染料―四环素进行染色标记，证实了此培养细胞具有成骨能力，从而从另一侧面证明了本细胞具有成骨细胞表型。此外，我们还对培养的细胞进行了冻存与复苏的研究，结果显示冻存后的细胞可长时间保存，并且复苏后仍具有上述稳定的生物学行为。

综上所述，本实验培养的细胞具有成骨细胞的形态和生物学特征；有良好的生长与增殖能力；经多次传代与冻融后其各种生物学行为保持稳定；并且始终保持人类细胞的核型，未发生染色体变异。本方法建立的细胞系产量大、周期短，因此可为临床骨生理与病理研究提供充足的、可靠的体外实验模型。另外，建立稳定的可冻存的人成骨细胞系，不仅对于骨组织工程修复创伤、感染、肿瘤所造成的大块骨缺损的研究具有重要意义。并且在教学和科研中可减少多次原代培养的麻烦，对于节省时间、经费，保证实验顺利进行提供了可靠的物质保证。